徐一新
- 作品数：4 被引量：12H指数：3
- 供职机构：上海健康医学院药学院更多>>
- 发文基金：上海市自然科学基金上海市教育委员会创新基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人g2型溶菌酶的多克隆抗体制备及其在睾丸中的表达分析被引量：3
- 2016年
- 目的以真核表达的人g2型溶菌酶(human goose-type lysozyme 2,LysG2)为免疫原制备抗LysG2的兔多克隆抗体,检测LysG2在睾丸组织中的定位,为阐明其生理功能提供线索。方法对LysG2毕赤酵母GS115转化菌株进行高密度培养,甲醇诱导目的蛋白表达并通过甲壳素亲和色谱纯化,以重组蛋白为免疫原制备兔抗LysG2多克隆抗体。通过ELISA检测抗体效价后,对人体各组织、精子及精液标本进行Western印迹分析,并对人睾丸组织进行免疫组化检测。结果以毕赤酵母表达LysG2为免疫原制备的抗体具有高效价,表达谱分析表明LysG2在睾丸中有表达,在精子蛋白提取物中没有检测到其存在,在精浆中检测到了LysG2。免疫组化检测结果显示LysG2在睾丸中主要定位于间质组织的Sertoli细胞。结论本研究成功以真核表达的LysG2制备了该蛋白多克隆抗体,LysG2在睾丸Sertoli细胞有表达,并分泌到精浆中,提示LysG2可能在男性生殖系统先天性免疫中发挥作用。
- 黄鹏杨智昉谢君徐一新鲍建瑛曹晓娥张宁余龙
- 关键词：毕赤酵母多克隆抗体睾丸先天性免疫
- 人源类溶菌酶蛋白4的多克隆抗体制备及其表达分析被引量：4
- 2017年
- 目的:以原核表达的人源类溶菌酶蛋白4(LYZL4)为免疫原制备多克隆抗体,检测LYZL4在睾丸组织中的定位,为阐明其生理功能提供依据。方法:将LYZL4编码基因克隆于原核表达载体pET32a,IPTG诱导重组LYZL4(r LYZL4)表达。分别使用Ni-NTA树脂和甲壳素亲和层析纯化rLYZL4,采用双层琼脂平板扩散法检测杀菌活性。以Ni-NTA树脂纯化产物为免疫原制备兔抗rLYZL4多克隆抗体,通过ELISA测定抗体效价,Western印迹检测抗体特异性后,检测LYZL4蛋白在人体各组织的分布及其在精子和精浆中存在情况,免疫组化确认LYZL4在人睾丸组织中的定位。结果:原核表达系统可有效表达rLYZL4,其对溶壁微球菌及大肠杆菌无杀灭活性。制备的兔抗rLYZL4多克隆抗体具有很高的效价和特异性,在睾丸、附睾及人精子蛋白提取物中可检测到LYZL4存在,在生精小管中,LYZL4定位于圆形精子细胞及长形精子细胞的顶体上。结论:本研究成功以原核表达的rLYZL4制备了该蛋白的多克隆抗体,确认LYZL4在睾丸和附睾有表达,并定位于精子顶体上,提示其可能与顶体结构或功能相关。
- 黄鹏杨智昉徐一新鲍建瑛张宁曹晓娥李文姝
- 关键词：原核表达系统多克隆抗体睾丸精子
- 人源类溶菌酶蛋白6在毕赤酵母中的重组表达及活性分析被引量：7
- 2015年
- 利用毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达人源类溶菌酶蛋白6(human lysozyme-like protein6,h Lyzl6),对其酶学性质进行分析。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成h Lyzl6基因,将其连接至含有乙醇氧化酶启动子(AOX1)的p PIC9K质粒构建重组表达载体p PIC9K-hlyzl6;重组表达载体经线性化后电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞,经G418筛选获得高拷贝重组菌株后进行甲醇诱导表达。经甲醇诱导72 h后发酵液上清中酶活性达到最高值,发酵液上清经SDSPAGE检测在14.8 k Da处有重组h Lyzl6蛋白条带,分子量符合预期,通过甲壳素亲和层析可对其进行纯化;采用比浊法测定h Lyzl6酶学活性,结果表明h Lyzl6对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)有较好的杀灭作用,最适反应温度为40℃,最适p H为5.5,其酶活力为54 700U/mg,Cu2+对其活性有明显抑制,EC50为30.2799 mg/L。采用基因工程方法首次在毕赤酵母GS115成功表达了重组h Lyzl6,证实其在体外具有杀菌活性,初步揭示h Lyzl6在男性生殖系统先天性免疫中发挥了一定作用,为进一步研究h Lyzl6的功能和应用开发奠定了基础。
- 黄鹏李文姝谢君鲍建瑛曹晓娥余龙徐一新
- 关键词：毕赤酵母杀菌活性
- 人源类溶菌酶蛋白6在男性生殖系统中的表达被引量：3
- 2016年
- 目的:检测人源类溶菌酶蛋白6(LYZL6)在男性生殖系统中的表达情况,以揭示其可能的生理功能。方法:将整合LYZL6编码基因的毕赤酵母菌株进行高密度培养,甲醇诱导表达后甲壳素亲和色谱纯化。采用双层琼脂平板扩散法观察重组LYZL6的杀菌活性。以纯化的重组蛋白为免疫原制备兔抗LYZL6多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。通过Western印迹检测LYZL6蛋白在人各组织及精液中的分布,并采用免疫组化法确认LYZL6在人睾丸中的表达情况。结果:在低p H条件下重组LYZL6对溶壁微球菌杀菌活性较高。以重组LYZL6为免疫原制备的抗体具有高效价,Western印迹检测表明LYZL6仅在睾丸和附睾中表达,且睾丸表达水平较高。在人精子蛋白提取物中检测到了LYZL6,精浆中并未检测到明显蛋白条带。免疫组化检测显示在睾丸组织中,LYZL6定位于晚期精母细胞及圆形精子细胞。结论:在低p H条件下,重组LYZL6具有较强的溶解细菌细胞壁的能力;LYZL6被睾丸上皮分泌后结合于精子上,提示LYZL6有可能在精卵融合过程的某个环节发挥作用。
- 黄鹏李文姝杨智昉徐一新鲍建瑛曹晓娥周培华李堃余龙
- 关键词：毕赤酵母真核表达杀菌活性多克隆抗体
