于志丹
- 作品数：17 被引量：18H指数：2
- 供职机构：齐齐哈尔大学生命科学与农林学院更多>>
- 发文基金：黑龙江省自然科学基金中央级公益性科研院所基本科研业务费专项齐齐哈尔市科学技术计划项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学文化科学轻工技术与工程更多>>
- 牛初乳IGF-1改进型ELISA检测方法的建立与应用
- 2014年
- 为了安全、快速、高效测定牛初乳中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的含量,试验建立了改进型酶联免疫吸附法(ELISA法),以牛初乳为原料,通过多重提纯方法得到牛初乳IGF-1待测物,采用改进型双抗体夹心法测定牛初乳IGF-1,通过建立标准曲线方程和误差率指数方程对检测结果进行判定。结果表明:试验建立了标准曲线方程y=0.004 4x+0.174 3和误差率指数方程y=1.177 5e-13.664x,相关系数(R2)分别为0.984 1,0.864 3,说明其存在良好的线性关系。2种待测物中牛初乳IGF-1的浓度测定结果分别为20.73 ng/m L、159.1 ng/m L,与高效液相色谱法(HPLC法)测定的结果误差分别为12.11%、3.51%,而应用误差率指数方程得到的误差分别为10.91%、2.18%,均小于上述误差,当待测样品中牛初乳IGF-1的浓度≥95.53 ng/m L时,检测结果的误差率(ER)≤5%。应用改进型ELISA法检测牛初乳IGF-1的结果准确可靠,检测方法方便、快捷、误差小、重现性高,适合推广应用。
- 莫继先王维禹孙婴宁于志丹吕建伟
- 关键词：牛初乳
- 猪传染性胃肠炎病毒spike蛋白亲和肽的原核表达被引量：1
- 2020年
- 【目的】原核表达猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)spike蛋白亲和肽(SQHT),检测其病毒亲和性,为建立TGEV诊断方法奠定理论和物质基础。【方法】人工合成TGEV spike蛋白亲和肽基因,亚克隆后将该基因分别插入至原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1中,构建重组质粒pET-32a-SQHT和pGEX-6p-SQHT,对重组质粒进行BamHⅠ单酶切和BamHⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。将重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),用IPTG进行诱导表达,对其表达产物的生物学活性进行检测。【结果】亚克隆获得了150 bp的TGEV spike蛋白亲和肽基因。成功构建了重组质粒pET-32a-SQHT和pGEX-6p-SQHT,并诱导表达出重组蛋白TRX-SQHT和GST-SQHT,其分子质量分别为25和31 ku。Western blot分析表明,2种重组蛋白与TGEV病毒粒子具有良好的亲和性;Dot-ELISA分析表明,2种重组蛋白与TGEV病毒粒子的最低结合滴度TCID50为5×102 mL-1。特异性试验表明,重组蛋白TRX-SQHT和GST-SQHT均可与TGEV产生特异性结合,而不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(PoRV)结合。【结论】使用原核细胞成功表达了TGEV spike蛋白亲和肽,表达的重组蛋白具有很好的TGEV特异亲和性。
- 于天飞董慧莹董慧莹谢鹏宇孙婉姝黎明黎明
- 关键词：猪传染性胃肠炎病毒SPIKE蛋白原核表达
- 鸡细小病毒研究进展被引量：2
- 2019年
- 鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)发现于20世纪80年代早期,普遍存在于患有发育障碍与矮小综合征(Runting stunting syndrome,RSS)病鸡的肠道内。RSS以腹泻、精神沉郁、体温调节障碍、生长迟缓、饲料消耗增加为主要特征,给养鸡业造成较大的经济损失。用于ChPV检测的方法包括PCR、real-time PCR、ELISA、高通量测序技术等,目前还没有可用于防治ChPV的特效疫苗和药物。文章综述了目前关于ChPV在分子生物学、流行病学、发病机制和诊断方法方面的最新研究进展,以期为我国ChPV相关方面的研究提供借鉴。
- 于天飞孙婉姝孙婉姝谢鹏宇黎明于志丹
- 关键词：分子生物学流行病学发病机制
- 电压感受蛋白的保守基序及其序列分析
- 2012年
- 本文旨在研究电压感受蛋白(voltage sensing proteins, VSPs)的保守基序、分析其序列特点并组建其电压感受模型。在UniProt数据库中的检索结果显示,现有的VSPs主要为电压门控型离子通道及电压依赖性磷酸激酶,其共同特点是均含有一个4次跨膜区,分别称为S1～S4 (Segment 1-4)。S1区主要负责其上膜与转运,S2～S4区是其感知膜电位变化的核心。profile-to-profile序列比对结果表明VSPs各跨膜区的保守基序非常相似,尤其是S4跨膜区均含基序[RK]-X(2)-R-X(2)-R-X(2)-[RK],其特点是带正电荷的精氨酸残基(R)与两个疏水性或不带电荷的氨基酸残基交替排列,这是VSPs感知膜电位变化的核心区域。同时,四个跨膜区内均含大量具有较高α-螺旋结构形成倾向性的疏水性氨基酸残基,这可能是VSPs(尤其是带有大量正电荷的S4区域)能在胞膜上稳定存在的主要原因。此外,S3区内带负电荷的天冬氨酸残基(D)的保守性对VSPs感知膜电位变化具有重要意义,天冬氨酸残基与S4区的静电作用还可增加S4区在膜上的稳定性。
- 王昌河谢振丽吕建伟于志丹邵淑丽
- 关键词：膜电位
- 醋酸沉淀法从牛初乳中提取IGF-1的工艺条件研究
- 2014年
- 目的:用醋酸沉淀法从牛初乳中提取牛初乳IGF-1,确定醋酸沉淀法的最佳工艺流程。方法:以新鲜牛初乳为原料,离心除去脂肪和少量杂质后,用醋酸溶液调节牛初乳为不同的pH值,离心后,分别收集上清液和沉淀,再用PBS洗涤沉淀物,离心后再次收集上清液和沉淀物,对2次收集的上清液和沉淀物进行蛋白浓度测定、SDS-PAGE法测定和ELISA法测定,确定最佳的醋酸沉淀法的工艺流程。结果:确定了"二步法"提取工艺流程:首先用醋酸溶液调整脱脂牛初乳的pH值为4.2,离心后,将沉淀物用PBS(p H=6.8)溶解,再次离心,收集上清液,将2次离心得到的上清液混合,其中牛初乳IGF-1的含量达到原脱脂牛初乳中的91.96%,同时可将酪蛋白等杂蛋白最大限度地除去。结论:醋酸沉淀法能够从牛初乳中提取IGF-1,且操作简单,收率高,适合工业化生产的要求。
- 莫继先孙婴宁王维禹于志丹吕建伟
- 禽类转录因子与DNA互作的研究方法
- 2017年
- 在禽类生长发育中,基因的适时适量表达起到至关重要的作用。研究转录因子与DNA的互作,对认识禽类生长发育过程具有重要意义。文章总结了禽类常用的转录因子与DNA互作研究方法,其中:生物信息学预测结合位点有助于针对性的开展后续研究;电泳迁移率变动分析(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)能够分别从体外和体内验证转录因子与DNA结合;双荧光素酶报告基因可以鉴定对转录活性的影响。综合运用上述方法可有效开展转录因子-DNA互作研究,有助于揭示禽类生长发育调控机制。
- 孙婴宁王维禹贾炳豪盛和宇于志丹王宁
- 关键词：转录因子DNA生物信息学预测
- 水禽核糖体蛋白S12与番鸭细小病毒结构蛋白VP1的体外相互作用研究被引量：1
- 2022年
- 为了探讨水禽核糖体蛋白S12(ribosomal protein S12,RPS12)与番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)结构蛋白VP1之间的相互作用关系,试验根据GenBank中已登录的北京鸭和浙东白鹅RPS12基因序列,人工合成重组质粒pUC57-DRPS12和pUC57-GRPS12,双酶切后回收目的片段,分别插到载体pGEX-6P-1中,构建重组质粒pGEX-DRPS12和pGEX-GRPS12。将pGEX-DRPS12、pGEX-GRPS12及含MDPV YL08株VP1基因的重组质粒pET-VP1分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达,利用HRP标记的GST或His标签单克隆抗体,通过Western-blot法鉴定重组蛋白,采用GST pull-down法体外检测水禽RPS12蛋白与VP1蛋白的相互作用情况。结果表明:获得的重组蛋白GST-DRPS12、GST-GRPS12和TRX-VP1分子质量分别为41.2,40.3,98.8 ku,浓度为1.32,1.29,0.81 mg/mL;重组蛋白TRX-VP1能够与MDPV YL08株感染的番鸭血清特异性结合,具有较好的反应原性;重组蛋白TRX-VP1可以和GST-DRPS12、GST-GRPS12在体外相互作用。说明MDPV VP1蛋白与水禽RPS12蛋白存在相互作用关系。
- 谢鹏宇孙婉姝于天飞李静尹海畅黎明黎明
- 关键词：番鸭细小病毒结构蛋白原核表达
- 番鸭细小病毒非结构蛋白NS1与水禽真核翻译延伸因子1A1的体外互作分析被引量：1
- 2021年
- 旨在探讨番鸭细小病毒(MDPV)非结构蛋白NS1与水禽真核翻译延伸因子1A1(eEF1A1)之间的互作关系。根据GenBank中已发表的北京鸭和浙东白鹅eEF1A1基因序列,经大肠杆菌偏爱密码子优化,人工合成的质粒分别命名为pUC57-DeEF1A1和pUC57-GeEF1A1;对含有MDPV YL08株NS1基因的重组质粒pUC57-NS1、pUC57-DeEF1A1和pUC57-GeEF1A1进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收目的片段后分别插入到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a中,构建了重组质粒pGEX-DeEF1A1、pET-GeEF1A1、pET-NS1和pGEX-NS1;重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白GST-DeEF1A1、TRX-GeEF1A1、TRX-NS1和GST-NS1的表达;采用HRP标记的GST单克隆抗体鉴定GST-DeEF1A1、HRP标记的His单克隆抗体鉴定TRX-GeEF1A1;采用HRP标记的His单克隆抗体鉴定TRX-NS1、HRP标记的GST单克隆抗体鉴定GST-NS1,采用MDPV感染番鸭血清鉴定TRX-NS1和GST-NS1的抗原性;采用GST pull-down试验验证GST-DeEF1A1与TRX-NS1、GST-NS1与TRX-GeEF1A1的互作。结果表明,获得的重组蛋白GST-DeEF1A1、TRX-GeEF1A1、TRX-NS1和GST-NS1的分子量分别为76.9,67.9,89.5,98.6 ku;GST-DeEF1A1和GST-NS1可与HRP标记的GST单克隆抗体特异性结合,TRX-GeEF1A1和TRX-NS1可与HRP标记的His单克隆抗体特异性结合;GST-NS1和TRX-NS1可与MDPV感染番鸭血清特异性结合,抗原性良好;GST pull-down试验中,GST-DeEF1A1可与TRX-NS1互作,GST-NS1不与TRX-GeEF1A1互作。本研究表明,MDPV NS1蛋白可以和北京鸭eEF1A1在体外相互作用而不能和浙东白鹅eEF1A1在体外相互作用,互作结果差异性可能与二者的102-106 aa,108 aa的氨基酸残基有关。
- 于天飞谢鹏宇谢鹏宇孙婉姝尹海畅黎明黎明
- 关键词：番鸭细小病毒非结构蛋白
- 抗鹅细小病毒NS1蛋白单克隆抗体可变区的原核表达
- 2021年
- 为了在大肠杆菌中表达抗鹅细小病毒(GPV)NS1蛋白单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因,并测定其与NS1蛋白结合活性。对抗GPV NS1蛋白单克隆抗体VL、VH基因核苷酸序列依据大肠杆菌偏爱密码子进行优化,人工合成获得了含有可变区基因的重组质粒pUC57-VL和pUC57-VH。然后用Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切pUC57-VL、pUC57-VH,回收340 bp的VL基因和370 bp的VH基因。目的基因通过Bam HⅠ/XhoⅠ多克隆位点分别插入至原核表达载体pET-32a,获得重组质粒pET-VL和pET-VH。重组质粒经Bam HⅠ单酶切和Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。重组质粒分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白TRX-VL和TRX-VH的表达,分子量分别为30.3,31.4 ku。纯化后的重组蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性结合,鉴定结果表明,获得的纯化蛋白为目的蛋白。间接ELISA分析表明,0.4μg的TRX-VH可与25 ng的GST-NS1蛋白特异性结合而0.4μg的TRX-VL不能与各包被量的GST-NS1蛋白特异性结合,TRX-VH与GST-NS1蛋白的特异性结合可被1∶200稀释的GPV感染鹅血清完全阻断。
- 于天飞谢鹏宇谢鹏宇孙婉姝尹海畅黎明黎明
- 关键词：鹅细小病毒非结构蛋白单克隆抗体原核表达
- 番鸭细小病毒非结构蛋白B细胞线性抗原表位的鉴定被引量：1
- 2016年
- 为了分析番鸭细小病毒(muscovy duck parvovirus,MDPV)YL08株NS1蛋白(氨基酸序列全长627 aa)抗原表位,本研究设计了一套覆盖整个NS1蛋白的短肽,短肽长为30个氨基酸左右,有10个氨基酸重叠。为了表达这些短肽,共设计合成了31对互补的寡核苷酸片段。每对寡核苷酸片段5'端磷酸化。上述寡核苷酸片段退火后,插入至原核表达载体p ET-32a(+)中,经IPTG诱导获得了相应重组蛋白的表达。利用切胶纯化的方法对表达蛋白进行了纯化。应用MDPV YL08株人工感染番鸭血清对表达的31个重组蛋白的抗原性进行了检测,Western blot结果表明,表达的7个融合蛋白NS(481-510)、NS(501-530)、NS(521-550)、NS(541-570)、NS(561-590)、NS(581-610)和NS(601-627)能被MDPV感染血清所识别,而其他融合蛋白不能被MDPV感染血清所识别。同时,上述7个表达的融合蛋白不与灭活MDPV免疫番鸭血清反应。综合上述试验结果,MDPV YL08株NS1蛋白的B细胞线性抗原表位区位于NS1蛋白的羧基末端481 aa^627 aa。Dot-ELISA试验表明,重组蛋白NS(501-530)的抗原性相对更强。本研究为建立基于抗原表位的MDPV自然感染和人工免疫番鸭的鉴别诊断方法提供了理论依据。
- 于天飞董慧莹黎明樊兴冬闫冰于志丹
- 关键词：番鸭细小病毒非结构蛋白抗原表位
