潘怡
- 作品数：10 被引量：82H指数：5
- 供职机构：北京大学生命科学学院蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 利用Gateway克隆技术大规模克隆拟南芥转录因子被引量：27
- 2004年
- 随着越来越多基因组全序列的测定完成,基因组的研究进入了功能研究阶段。功能基因组的研究需要把大量基因连入不同载体,传统的酶切连接构建载体的方法不能满足这种大规模克隆的需要。Gateway技术是一种高效的大规模克隆系统,而且对载体和宿主没有依赖性。本文利用Gateway大规模克隆技术将16个拟南芥转录因子的ORF克隆入植物表达载pPTV和酵母表达载体pYTV中,酵母融合表达实验和West-ern-blot检测证明了该克隆途径的可行性,并且得到的His-Tag融合蛋白,为拟南芥转录因子的大规模蛋白质组学研究奠定了良好的基础,同时基因序列的聚类分析为将来进一步的功能研究提供了有利信息。
- 梅文倩宋文强潘怡巩威朱玉贤
- 关键词：拟南芥转录因子聚类分析功能基因组
- 结核分枝杆菌MPT-64分泌蛋白在原核表达载体中的克隆,表达与鉴定
- 2002年
- 目的 对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT - 6 4基因进行克隆 ,鉴定与表达 ,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法 以结核杆菌H3 7Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR法对基因MPT - 6 4进行扩增 ,产物与载体质粒pGEX - 4T - 1构建表达MPT - 6 4的重组质粒 ,将此重组质粒先转化到E coliDH5α内抽提质粒 ,酶切检验 ,再转化入表达宿主E coliBL2 1(DE3)PLysS菌株内 ,对转化菌株以IPTG进行诱导后 ,破菌 ,离心 ,上清进行SDS -PAGE ,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫染色 ,一抗为结核分枝杆菌菌株H37Rv羊抗阳性血清。结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,所表达的蛋白质相对分子质量为 5 0 0 0 0 ,抗体检测有特异带大小为 5 0kDa。结论 目的基因克隆到菌株内 ,重组结核杆菌分泌蛋白MPT - 6 4的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及上述抗原。
- 蔡宏潘怡汪竟朱玉贤
- 关键词：结核分枝杆菌分泌蛋白克隆结核病
- 拟南芥转录因子的大规模克隆及DNA结合特性研究
- AP2/EREBP和bHLH转录因子是植物体内两个重要的转录因子大家族.其中AP2/EREBP是植物体所特有的转录调节蛋白.该文根据基因注释,从不同状态的植株中得到目的片段,用gateway克隆技术已经分别将94个AP2...
- 潘怡
- 关键词：转录因子AP2/EREBPBHLHGATEWAYEMSA
- 结核分枝杆菌三种分泌蛋白在真核表达载体中的克隆、表达与鉴定
- 结核病是一种人、畜共患的慢性消耗性传染病。随着爱滋病人数的增加、新的抗药性菌株的产生、大量贫困国家的移民涌入较为发达国家,结核病的发病率有逐年增加的趋势。据国外有关资料报道,目前世界上有约20亿人口感染有结核杆菌,每年有...
- 蔡宏潘怡汪竞朱玉贤
- 文献传递
- 结核分枝杆菌四联核酸疫苗免疫原性和保护效率被引量：15
- 2003年
- 对结核杆菌四联DNA疫苗的免疫应答和保护效果进行了评价。用结核分枝杆菌Ag85B,MPT-64,MPT-63和ESAT-6等4个分泌蛋白基因的表达载体首次免疫小鼠21d后,Ag85B抗体滴度达到1:200,二次免疫后为1:102400,三次免疫后为1:1288。MPT-64和MPT-63的抗体滴度在首次免疫21d后即高达1:25600,二、三次免疫后呈下降趋势。三次免疫21d后均未检测到ESAT-6的特异性抗体。用该DNA四联苗免疫小鼠后,4种蛋白都诱导脾脏细胞产生较高水平的细胞应答(产生了特异性γ-干扰素)。三次免疫后经静脉强毒攻击,四联苗免疫组小鼠肺脏的细菌数比对照空载体组减少了99.8％,保护水平显著高于BCG疫苗组、对肺组织的病理形态特征观察表明,空载体pJW4303的对照小鼠,肺部严重损伤,肺实质干酪样坏死,坏死结节占肺实质的50％～70％,而四联苗免疫的小鼠,肺组织结构正常,实质无肉芽肿,肺泡轮廓清晰。研究证实,Ag85B,MPT-64,MPT-63和ESAT-6四种分泌蛋白编码基因组成的四联DNA疫苗具有很高的免疫应答水平和保护效率。
- 蔡宏田霞呼西旦潘怡李国利庄玉辉朱玉贤
- 关键词：结核病结核分枝杆菌免疫原性免疫应答
- 结核分枝杆菌三种分泌蛋白在原核表达载体中的克隆、表达与鉴定被引量：10
- 2002年
- 对结核分枝杆菌的三种分泌蛋白Ag85B ,ESAT_6和MPT_6 4基因进行克隆、鉴定与表达 ,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。以结核杆菌H37RV 株基因组DNA为模板 ,用PCR法对基因Ag85B、ESAT_6、MPT_6 4进行扩增 ,产物与载体质粒pET2 2b和pGEX_4T_1构建表达Ag85B、ESAT_6、MPT_6 4的重组质粒 ,将此重组质粒先转化到大肠杆菌DH5a内抽提质粒 ,酶切检验 ,再转化入表达宿主大肠杆菌BL2 1(DE3)PLysS菌株内 ,对转化菌株以IPTG进行诱导后 ,破菌 ,离心 ,上清进行SDS_PAGE电泳 ,电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,所表达的蛋白质相对分子质量为 30 0 0 0、6 0 0 0、5 0 0 0 0。结果表明 :目的基因克隆到菌株内 ,重组结核杆菌分泌蛋白Ag85B、ESAT_6、MPT_6 4的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及上述三种抗原。
- 蔡宏潘怡汪竟朱玉贤
- 关键词：人畜共患病结核分枝杆菌分泌蛋白原核克隆
- 结核分枝杆菌多价核酸疫苗的构建及免疫原性被引量：18
- 2002年
- 将编码结核分枝杆菌MPT-64,Ag85B和ESAT-6分泌蛋白的结构基因或包括信号肽的全基因序列定向克隆到真核表达载体pJW4303中,转化到TOP10大肠杆菌,提取质粒DNA,经限制性核酸内切酶鉴定及序列分析证实含有正确的上述3种分泌蛋白的结构基因（包括信号肽）全序列.用脂质体介导法将重组表达质粒导入COS7细胞内并进行瞬时表达,收集表达细胞或浓缩上清液,12％或15％的 SDS-PAGE电泳分离,用结核杆菌特异性抗体进行免疫印迹杂交,证明上述3种重组质粒能在哺乳动物细胞中表达出特异蛋白.3种重组表达质粒同时肌注免疫小鼠21d后,Ag85B抗体的平均滴度即达到 1:3200,第2次免疫21d后达到1:102400.MPT-64抗体的平均滴度在首免21d后为1:50.第2次免疫21后为1:200.两次免疫21d后均未检测到ESAT-6的特异性抗体.三免21后Ag85B的特异性细胞因子γ-干扰素的浓度为110pg/mL;而 MPT-64和ESAT-6的γ-干扰素浓度未检测到.实验在国内首次用结核杆菌多价DNA疫苗对小鼠进行了免疫实验,二免后的抗体水平已达到或超过国内外已报道的单价苗最高抗体水平,表明多价核酸疫苗和分泌型蛋白载体有利于增强疫苗的保护性应答.
- 蔡宏潘怡朱玉贤李国利庄玉辉
- 关键词：结核分枝杆菌免疫原性细胞应答结核病体液免疫应答
- 结核分支杆菌MPT83在真核、原核表达载体中的克隆、表达与鉴定被引量：3
- 2003年
- 为了克隆、鉴定和表达结核分支杆菌抗原蛋白 MPT83 ,为结核病的诊断以及亚单位疫苗、核酸疫苗的制备和应用奠定基础。以结核分支杆菌标准菌株 H3 7RV基因组 DNA为模板 ,PCR扩增目的基因 mpt83 ,扩增产物酶切后分别克隆到真核、原核表达载体 p JW43 0 3和p ET2 2 b( +)中 ,构成重组真、原核表达载体 83eu和 MPT83。经酶切和序列鉴定为正确的重组真核表达载体 83 eu和重组原核表达载体MPT83 ,分别转染 COS7细胞和转化 BL2 1( DE3 ) plys S。结果表明 ,经 SDS-PAGE、Westernblotting检测显示 ,IPTG诱导的原核表达载体MPT83在 2 .6万处有正确而特异的蛋白条带 ;转染 COS7细胞的真核表达载体 83 eu。
- 田霞呼西旦潘怡朱玉贤蔡宏
- 关键词：分支杆菌真核原核克隆
- MPT63核酸疫苗的制备及其免疫原性被引量：5
- 2003年
- 扩增结核分枝杆菌分泌蛋白MPT63编码序列 ,克隆于真核表达载体pJW 4 30 3中 .转染COS 7细胞 ,用Western印迹检测表明该基因在细胞内得到正确表达 .用该质粒连续免疫C5 7BL 6小鼠 3次后 ,用纯化的重组蛋白MPT63检测小鼠血清中的抗体 ,发现抗体滴度达到 10 5,免疫动物中γ干扰素的含量达到 2 5 8± 0 2U ml ,为空载体DNA免疫对照组的 2 0倍以上 。
- 潘怡蔡宏李淑霞李唐朱玉贤
- 关键词：核酸疫苗免疫原性结核病结核分枝杆菌分泌蛋白
