高峰
- 作品数：65 被引量：309H指数：10
- 供职机构：华中科技大学同济医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金贝朗麻醉科学研究基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学文化科学更多>>
- β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体体外基因沉默效应研究被引量：1
- 2011年
- 目的:探讨β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体在体外工具细胞中的基因沉默效应及其携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达。方法:用构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒感染NG108-15细胞,实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测β-arrestin2抗基因RNA慢病毒对工具细胞的β-arrestin2 mRNA和蛋白表达的下调作用,以及该病毒所携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达。结果:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒能显著降低工具细胞中β-arrestin2 mRNA和蛋白的表达,与对照组相比实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测的沉默效率分别为79%和82%(P<0.05)。感染病毒组的NG108-15细胞的铁蛋白表达量显著升高,是对照组细胞的2.29倍(P<0.05)。结论:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在工具细胞中对β-arrestin2基因具有显著的沉默效应,该病毒携带的铁蛋白报告基因在工具细胞中表达。成功验证了β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在体外的基因沉默效应和铁蛋白报告基因的表达,为该病毒的在体研究奠定了基础。
- 刘希江高峰卜慧莲徐懋曹菲田学愎杨辉田玉科
- 关键词：基因沉默慢病毒载体铁蛋白
- 大鼠源性重组天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3基因构建及其对细胞的促凋亡效应被引量：3
- 2009年
- 目的探讨大鼠源性重组天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）基因对细胞的促凋亡作用。方法通过重组PCR的方法获得大小亚基顺序颠倒的大鼠重组caspase-3基因，构建真核表达载体，分别转染人胚肾293T细胞和大鼠永生化神经干细胞后观察细胞形态学变化，通过Annexin V-PI双染、流式细胞术、MTr法来检测其促细胞凋亡作用。结果转染后，细胞出现明显的核碎裂，死亡；MTTr法检测发现细胞增殖明显被抑制（抑制率为（48．35±0．16）％和（44．61±0．15）％（P〈0．05）；Annexin V-PI共染色流式细胞术检测两种细胞的凋亡率分别为（30．7±1．5）％和（16．0±1．0）％，较对照组细胞有显著的增加（P〈0．05）。结论大鼠源性重组caspase-3基因可在转染的人和大鼠细胞中表达，并诱导细胞发生凋亡，不仅可有效用于体内实验研究，且能用于诱导神经细胞凋亡。
- 陈莎莎曹菲高峰许爱军田学愎肖兴鹏杨少兵田玉科
- 关键词：CASPASE-3凋亡
- 肝特异性胰岛素样生长因子-I基因敲除鼠乳腺癌组织中基因变化及胰岛素样生长因子-I对血管生成的影响被引量：2
- 2008年
- 目的探讨低血清胰岛素样生长因子-I（IGF-I）水平小鼠及正常水平小鼠乳腺癌模型中生长因子相关基因的变化及血管内皮细胞生长因子在乳腺癌组织中的表达与微血管密度的关系。方法应用DMBA诱导肝脏特异性IGF-I基因敲除鼠（LID鼠）及基因未敲除鼠（对照鼠）建立原发乳腺癌模型，基因芯片技术检测小鼠乳腺肿瘤及正常乳腺组织中相关基因的差异表达，免疫组织化学法检测其中VEGF表达及微血管密度。结果LID鼠组肿瘤的发生时间、生长速度及大小均低于对照组（P〈0．05）；（2）LID鼠组肿瘤组织的VEGF表达及MVD均弱于对照鼠组（P〈0．05）；（3）LID鼠组肿瘤组织中基因IGF-I、IGFBP-4、IGFBP-7较对照组上调，而基因IGF-Ⅱ，IGF-ⅡR、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-5下调。结论IGF-I促进小鼠乳腺癌的发生发展，且与血管生长密切相关。IGF-I在肿瘤的发生、发展及转移中可能起重要作用。
- 任玉萍唐泓波张军马士辉高峰吴毅平
- 关键词：胰岛素样生长因子-I基因芯片
- 人NF-κB亚基p65、p50基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的建立和鉴定被引量：2
- 2008年
- 目的构建分别携带人核因子-κB(NF-κB)亚基p65、p50基因的逆转录病毒载体,并建立稳定产毒的包装细胞株。方法以RcCMV-p65、RcCMV-p50质粒为模板,PCR扩增p65、p50基因编码区全长序列,分别克隆至逆转录病毒空载体pMSCVneo、pMSCVhyg,酶切、测序鉴定。将重组载体及空载体分别转染包装细胞系PT67,以G418或潮霉素筛选产毒细胞株。收集病毒悬液,测定病毒滴度,并瞬时感染NIH3T3细胞及人神经干细胞,72h后分别采用RT-PCR和免疫细胞化学观察p65、p50的表达。结果重组逆转录病毒载体pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50的酶切、测序鉴定正确。将筛选所得的高效产毒细胞株分别命名为PT67/pMSCVneo-p65、PT67/pMSCVneo、PT67/pMSCVhyg-p50及PT67/pMSCVhyg,测定病毒滴度分别为4×105、6×105、2×105及1×105cfu/ml。pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50病毒悬液瞬时感染NIH3T3细胞72h后,细胞p65、p50亚基mRNA的表达明显升高;瞬时感染人神经干细胞(hNSC)72h后,部分细胞胞核呈p65和p50阳性染色。结论成功构建了分别携带人p65、p50基因的逆转录病毒载体,建立了稳定、高效、正确生产逆转录病毒的细胞株。为探讨转NF-κB基因神经干细胞在缺血性卒中的运用前景奠定了实验基础。
- 桂伶俐刘志恒张传汉祝畅高峰
- 关键词：干细胞移植核因子ΚB逆转录病毒科
- 人胚不同脑区神经前体细胞的分离培养及分化特性的比较被引量：1
- 2007年
- 目的研究人胚不同脑区神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)培养及增殖分化特性。方法取14-17周人胚脑区组织,分为新皮质、纹状体、间脑、中脑、后脑和延髓组,悬浮培养。鉴定细胞球巢蛋白抗原的表达,分化及自我更新能力。观察各脑区培养细胞的生长、增殖状况。新皮质、纹状体及间脑来源的神经球分化后,运用免疫荧光细胞化学法比较神经元及星形胶质细胞的比例。结果各脑区培养出的悬浮细胞球巢蛋白抗原阳性,可分化为MAP2或GFAP阳性细胞,且BrdU掺入实验阳性。体外培养第3d,纹状体及间脑组均可见大量神经球,且纹状体组明显多于间脑组;新皮质组传代后可见较多神经球;其它组仅见个别神经球。新皮质、纹状体、间脑来源的NPCs诱导分化后,MAP2或GFAP阳性细胞率各组间比较差异无显著性。结论人胚不同脑区均可培养出NPCs,从易到难依次为纹状体、间脑、新皮质及其它脑区。新皮质、纹状体、间脑来源的NPCs体外分化比例一致。
- 桂伶俐刘志恒张传汉祝畅高峰
- 关键词：细胞培养神经前体细胞细胞分化
- 脊髓原钙粘蛋白20在大鼠骨癌痛形成中的作用
- 2012年
- 目的探讨脊髓原钙粘蛋白20（PCDH20）在大鼠骨癌痛形成中的作用。方法SPF级雌性SD大鼠36只，体重180～200g，采用随机数字表法，将大鼠随机分为4组（n=9）：假手术组（S组）、骨癌痛组（BCP组）、慢病毒对照组（LC组）、PCDH20siRNA-LV组（P组）。LC组和P组分别于脊髓内注射对照慢病毒和PCDH20 siRNA慢病毒4μl。1周后建立骨癌痛模型，采用右侧胫骨上段骨髓腔内注射Walker256乳腺癌细胞的方法制备。于病毒注射前1d（T1）、骨癌痛模型建立前1d（T2）、模型建立后7、14和21d（T3、T4、T5）时测定机械缩足阈值（MWT）。骨癌痛模型建立后21dMWT测定结束后，取术侧胫骨，HE染色后光镜下观察胫骨癌细胞侵犯情况；取脊髓组织，采用免疫组化法和Western blot法测定脊髓PCDH20和突触后致密物蛋白质95（PSD95）蛋白的表达水平，采用RT-PCR法测定脊髓PCDH20和PSD95mRNA的表达水平。结果BCP组、LC组及P组肿瘤细胞突破骨髓腔，侵犯骨皮质，骨皮质结构严重破坏；与S组比较，BCP组、LC组和P组B～L时MWT明显降低，BCP组和LC组脊髓PCDH20和PSD95mRNA及其蛋白表达水平明显上调，P组脊髓PCDH20蛋白水平上调（P〈0．05）；与BCP组比较，LC组各时点MWT、脊髓PCDH20和PSD95mRNA及其蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P〉0．05），P组Td和B时MWT明显升高，脊髓PCDH20和PSD95mRNA及其蛋白表达水平下调（P〈0．05）。结论PCDH20通过调控大鼠脊髓PSD95的表达，调节兴奋性突触的功能，从而参与骨癌痛的形成。
- 李彩娟柯昌斌时代何文胜卜慧莲高峰田玉科
- 关键词：钙黏着糖蛋白类骨肿瘤疼痛
- 构建大鼠前甘丙肽原基因修饰永生化星形胶质细胞株对镇痛研究的意义被引量：1
- 2005年
- 目的:转基因细胞移植镇痛是慢性疼痛治疗的新方向,构建大鼠前甘丙肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株,为转甘丙肽基因细胞移植镇痛的研究提供理论依据。方法:实验于2003-05/2004-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学研究室完成。采用DNA重组技术将质粒pBSKS(+)-前甘丙肽原中的大鼠前甘丙肽原基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,经酶切鉴定和测序分析后,采用脂质体介导法将重组质粒pcD-NA3.1(+)-前甘丙肽原和空质粒pcDNA3.1(+)分别转染永生化大鼠星形胶质细胞株,经G418(600mg/L)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养。采用免疫细胞化学法、反转录-聚合酶链反应和放射免疫法检测转染细胞大鼠甘丙肽的表达及分泌,同时检测Neo基因的存在以证实转染成功。结果:重组质粒经酶切后分别出现5.4kb和521bp片段,测序分析与文献报道结果一致,表明重组质粒pcDNA3.1(+)-前甘丙肽原亚克隆成功。Neo基因检测显示重组质粒和空质粒已成功转染到星形胶质细胞株中,筛选获得星形胶质细胞株/前甘丙肽原和星形胶质细胞株/Neo两种细胞株。星形胶质细胞株,星形胶质细胞株/前甘丙肽原和星形胶质细胞株/Neo的前甘丙肽原免疫染色均阳性,平均光密度分析结果显示星形胶质细胞株/前甘丙肽原的前甘丙肽原表达明显高于星形胶质细?
- 安珂田玉科杨辉高峰王鹏
- 关键词：镇痛神经肽类星形细胞
- 吗啡、芬太尼、曲马多对Jurkat细胞核因子κB和IL-2合成的影响被引量：11
- 2007年
- 目的：研究吗啡、芬太尼、曲马多对人T淋巴瘤细胞系Jurkat细胞免疫应答的影响.方法：将Jurkat细胞分裂成（1.5～2）×10^8L^-1,体外培养12～16 h,以10倍血药质量浓度的曲马多（7.5 mg·L^-1）、吗啡（38 mg·L^-1）、芬太尼（20 μg·L^-1）分别孵育 Jurkat细胞,再以0.25 mg·L^-1PMA诱导1 h后,离心分离,用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清液中白细胞介素2（IL-2）的水平.提取沉淀细胞内蛋白质,用凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）检测核因子κB（NF-κB）的活性.结果：PMA可激活NF-κB,吗啡和芬太尼显著减弱NF-κB活性,而曲马多对PMA激活的NF-κB活性无影响.PMA刺激后,Jurkat细胞IL-2分泌水平由（10.0±2.4）ng·L^-1上升为（17.9±5.6）ng·L^-1（P＜0.05）.吗啡可明显抑制IL-2水平至（12.6±3.8）ng·L^-1,较PMA刺激组明显降低（P＜0.05）;芬太尼诱导后IL-2分泌水平显著下降,为（14.2±4.9）ng·L^-1（P＜0.05）;曲马多诱导后的IL-2分泌水平为（28.6±5.6）ng·L^-1,明显高于PMA刺激组（P＜0.05）.结论：曲马多可促进Jurkat细胞IL-2的分泌,对NF-κB活性无影响,但吗啡和芬太尼对NF-κB活性及IL-2合成可产生显著抑制作用.
- 刘志恒高峰田玉科
- 关键词：吗啡芬太尼曲马多核因子ΚB
- N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基基因重组腺病毒镇痛疫苗的构建被引量：1
- 2007年
- 目的构建携带N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基（NR2B）基因的重组腺病毒镇痛疫苗。方法以携带NR2B基因的腺病毒穿梭质粒pDC515-NR2B和腺病毒骨架质粒pBHGfrt（del）E1，3FLP共转染腺病毒包装细胞293细胞，连续观察细胞的形态学。取形成病毒空斑的293细胞，分别采用PCR、RT-PCR及Western blotting的方法从基因水平、转录水平和蛋白水平对病毒空斑筛选和鉴定，对鉴定正确的病毒空斑进行扩增和纯化。结果转染后12d可观察到细胞病变效应，15d后形成病毒空斑。NR2B基因不仅正确插入重组腺病毒载体，而且可在293细胞正确表达NR2B蛋白。鉴定正确的病毒空斑命名为NR2B基因重组腺病毒5型镇痛疫苗，滴度为5×10^11VP／ml，纯度100％。结论成功地构建了NR2B基因重组腺病毒镇痛疫苗，可用于疫苗镇痛的研究。
- 王公明陈建平杨少兵田学愎高峰杨辉安珂田玉科
- 关键词：受体腺病毒科疫苗镇痛
- 小鼠Cxcl10基因shRNA慢病毒表达载体构建与基因沉默效果鉴定
- 2013年
- 目的构建携带趋化因子一Cxcl10shRNA的慢病毒表达载体，并鉴定其在BV一2细胞中的沉默效果。方法将含有针对小鼠Cxcl10的ShRNA序列克隆到pGC—LV载体中，包装浓缩后用293T细胞测定病毒滴度。将Cxcl10ShRNA慢病毒载体分别以感染复数MOI为1，10和100的条件感染BV一2细胞，72h后采用real．timePCR技术和Western印迹检测shRNA对Cxcl10基因的沉默效果。结果Cxcl10ShRNA被成功构建入慢病毒表达载体pGC—LV，病毒滴度为5×10。TU／ml。用感染复数（MOI）为1或10的shRNA慢病毒感染BV．2细胞，可沉默约35％的Cxcl10基因表达，当MOI为100时，Cxcl10基因的沉默效果为65％，并可有效下调CXCLl0蛋白的表达。结论成功构建了携带Cxcl10shRNA的慢病毒载体．为研究趋化因子CXCLl0在疼痛、吗啡镇痛中的作用提供了有效的研究工具。
- 卜慧莲舒斌王伟高峰田玉科
- 关键词：慢病毒载体趋化因子基因沉默短发卡RNA
