张雪利
- 作品数：7 被引量：19H指数：3
- 供职机构：广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省科技厅国际合作项目国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 红笛鲷tdt基因融合蛋白原核表达条件的优化及纯化被引量：6
- 2013年
- 克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)末端脱氧核糖核酸转移酶TdT蛋白(Terminal deoxynucleotidyl transferases)成熟肽基因序列,并与pET-32a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-32a-TdT,再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。运用传统方法优化诱导条件,以提高重组融合蛋白的表达效率。SDS-PAGE分析表明,37℃、0.7 mmol/L IPTG条件下诱导4 h后,TdT融合蛋白的表达量最大,分子质量大小与预测值相符,该蛋白主要以包涵体形式存在。利用HisTrap HP亲和层析柱使TdT蛋白得到进一步纯化,最佳咪唑洗脱浓度为300 mmol/L,Western blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性的结合,表明表达蛋白为目的蛋白。
- 黄瑜张雪利鲁义善简纪常吴灶和黄浦江周泽军
- 关键词：红笛鲷原核表达纯化WESTERNBLOT分析
- 红笛鲷RAG基因的克隆及表达分析
- 红笛鲷(Lutjanus sanguineus)俗称红鱼、红曹鱼，是我国南方沿海主要的经济鱼类之一。然而随着水产养殖业的迅猛发展，疾病频繁暴发，给红笛鲷养殖业造成巨大的经济损失。对鱼类的免疫系统及其抵御外界感染的免疫反应...
- 张雪利鲁义善吴灶和简纪常
- 关键词：红笛鲷RAGCDNAREAL-TIMEPCR
- 红笛鲷T淋巴细胞酪氨酸激酶的原核表达及多克隆抗体制备被引量：2
- 2013年
- 为研究红笛鲷(Lutjanus sanguineus)T淋巴细胞酪氨酸激酶(Lymphocyte cell kinase,LCK)蛋白在机体中的组织分布情况,克隆出红笛鲷lck(LS-lck)基因序列,经酶切、连接等步骤,构建重组质粒pET-28a-LS-LCK,再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株后进行IPTG诱导表达。通过表达条件的优化,重组蛋白在37℃、0.03 mmol/L IPTG条件下诱导4 h后获得最大表达量,且主要以包涵体形式存在。Western blot检测重组蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,表明为目的蛋白。利用纯化后的rLS-LCK重组蛋白免疫小鼠,获得了1∶40 000高效价的抗血清,Western blot分析显示,融合蛋白能被小鼠的阳性血清识别,说明rLS-LCK融合蛋白具有较好的免疫反应性和免疫原性。
- 黄瑜张雪利蔡佳简纪常吴灶和鲁义善樊云霞
- 关键词：红笛鲷原核表达BLOT分析抗原性分析
- 红笛鲷重组激活基因rag1原核表达条件的优化及纯化被引量：3
- 2012年
- 克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)RAG1蛋白(recombination activating protein1)活性核心区的基因序列,并与pET-28a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-28a-RAG1,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用IPTG进行诱导表达。为提高融合蛋白的表达效率,运用传统的实验方法对诱导条件进行优化。SDS-PAGE分析表明,在37℃条件下,利用0.1 mmol/L IPTG诱导8 h后,RAG1重组融合蛋白的表达量最大,相对分子质量与预测值相符,该蛋白主要以包涵体形式高效表达,利用His Trap HP亲和柱使其得到进一步纯化;Western blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,说明表达蛋白为目的蛋白。
- 张雪利鲁义善谢吉国简纪常吴灶和
- 关键词：红笛鲷原核表达纯化WESTERNBLOT分析
- 红笛鲷(Lutjanus sanguineus)C型凝集素基因的克隆与组织表达分析被引量：1
- 2015年
- 根据已知的海水鱼类C型凝集素基因的核苷酸保守区序列设计一对简并引物,先后通过RT-PCR和RACE PCR法从红笛鲷脾脏中首次克隆获得红笛鲷C型凝集素(CTL)基因的c DNA全长(登录号:AGT37609)。该序列长828 bp,开放阅读框663 bp,编码220个氨基酸。氨基酸序列分析显示,红笛鲷CTL基因氨基酸序列与其他物种CTL的相似性在30%-68%之间。系统进化分析表明,红笛鲷C型凝集素与鳉鱼、条石鲷、斜带石斑鱼CTL蛋白亲缘关系最近,聚成一支。通过荧光定量PCR分析红笛鲷基因的组织差异表达,红笛鲷CTL基因在肝、脾以及皮肤中表达水平较高,其次是头肾、肾、胃、肠及肌肉,在心脏与脑中表达量较低。
- 蔡佳张雪利吴灶和简纪常鲁义善冯东岳焦茂兴
- 关键词：红笛鲷C型凝集素基因克隆组织表达分析
- 哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因克隆、表达及DNA疫苗的免疫效果被引量：7
- 2013年
- 参照GenBank上登录的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因序列，设计引物扩增OmpW的开放阅读框，序列分析结果显示该基因全长645bp。将其定向克隆到原核表达载体pET-32a（＋），在大肠杆菌BL21中成功表达出带His-tag的融合蛋白，融合蛋白分子量约为43．8ku，且主要以包涵体形式存在。优化的表达条件为37oC，IPTG浓度0．1mmol／L，诱导时间5h。将纯化的融合蛋白免疫SPF昆明小鼠制备多克隆抗体，ELISA方法检测抗体效价达1：30000，Western．Blot结果表明鼠抗OmpW血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应，提示OmpW可能是哈维氏弧菌的一种重要保护性抗原。为进一步研究哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护效果，构建了真核表达重组质粒pcDNA-OmpW，然后将真核质粒免疫接种红笛鲷。PCR结果显示，免疫接种后第7—28天，在红笛鲷的肌肉、头肾、肝脏和脾脏组织中均存在质粒分布；RT．PCR结果显示，免疫接种后第7～28天，红笛鲷上述组织均有目的基因的表达。ELISA结果表明，红笛鲷体内血清产生了抗OmpW蛋白的高效价抗体。Western．Blot分析表明，DNA疫苗免疫后红笛鲷体内表达了相应的目的蛋白，并诱导产生了相应抗体。攻毒实验结果表明，免疫保护率高达60％，可见pcDNA-OmpW可作为红笛鲷预防哈维氏弧菌感染的有效候选疫苗之一。
- 黄浦江黄郁葱简纪常吴灶和鲁义善张雪利
- 关键词：哈维氏弧菌外膜蛋白免疫原性DNA疫苗
- 红笛鲷重组激活基因克隆及表达分析
- 重组激活基因(recombination activating genes，rag)是脊椎动物特异性免疫反应的关键基因，是免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)和T细胞受体(T cellreceptor，TCR...
- 张雪利
- 关键词：红笛鲷原核表达免疫组织化学基因克隆淋巴细胞
