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种子春化型芥菜BjSVP与绿体春化型甘蓝BoFLC异源蛋白互作的研究: 甘蓝(Brassica oleracea L.)和芥菜(Brassica juncea Coss.)都是我国普遍种植的蔬菜作物。均属于十字花科芸薹属，它们必须通过低温春化处理才能生长开花。其中，芥菜属于种子春化型即种子处...; 杨朴丽; 关键词：芥菜甘蓝酵母双杂交技术; 文献传递

结球甘蓝雌蕊发育调控因子SPT与HEC1的基因克隆及相互作用: 2014年; 为研究SPT和HEC及其相互作用对甘蓝雌蕊发育的影响,以结球甘蓝自交不亲和系E1为材料,提取雌蕊总RNA,根据拟南芥中SPT和HEC1基因设计引物,采用同源克隆方法克隆SPT基因,其序列1085 bp,开放阅读框(ORF)1062 bp;HEC1基因ORF 696 bp。通过cDNA推导得到的氨基酸序列表明,SPT编码353个氨基酸残基,预测分子量为37.67 kD,pI为6.83;HEC1编码231个氨基酸残基,预测分子量为25.26 kD,pI为10.2。两基因在各器官中均表达,但SPT在果实和雌蕊中表达量最高,而HEC1在根和花蕾中的表达量最高。为检测两者的相互作用,构建原核表达质粒pCold I-SPT和pGEX-HEC1,pull-down试验表明两蛋白能够在体外相互作用。同时构建pGBKT7-SPT、pGADT7-HEC1及互换载体pGBKT7-HEC1和pGADT7-SPT酵母表达载体,分别转化酵母Y2HGold和Y187感受态细胞后均未出现自激活和毒性现象,融合后的二倍体酵母均能在SD/–Trp–Leu–Ade–His/X-α-gal/AbA板上长出蓝色菌斑,表明SPT和HEC1能够相互作用激活下游的HIS3、AUR1-C、MEL1和ADE2报告基因,酵母双杂交试验结果与Pull-down检测一致,说明SPT和HEC1能够相互作用以调控雌蕊的发育。; 许俊强孙梓健刘智宇杨朴丽汤青林王志敏宋明王小佳; 关键词：结球甘蓝雌蕊 SPT 相互作用酵母双杂交

开花负调因子芥菜BjSVP与甘蓝BoFLC的异源互作研究: 2013年; 为阐明开花负调因子BjSVP（源于种子春化型作物芥菜）与BoFLC（源于绿体春化作物甘蓝）异源聚合后在开花调控路径中的互作机制，从芥菜酵母重组质粒pGADT7．SjSVP分别亚克隆含MI、MIK、K、IKC、KC、IK、IKlLlK2L2、IKlLlK2、IKlLl、IKl、I结构域的11个SVP截短体（sjsve,al～BjSVPAll），构建猎物质粒pGADT7—13jSVPAl～pGADT7一BjSVPAll并转化酵母Y187菌；从甘蓝中克隆了BoFLC和BoFLCzq基因，构建诱饵质粒pGBKT7．BoFLC、pGBKT7．BoFLCzq并转化酵母Y2HGold菌。酵母双杂交表明：芥菜BjSVP能与甘蓝BoFLC相互作用，在QDO／X／A培养基上长出蓝色菌落，激活酵母报告基因AURl-C、HIS3、ADE2、MELl。截短体BjSVPA2～BjSVPA5也能与BoFLC相互作用，而BjSVPA7～BiSVPAll不能与BoFLC互作。由此表明BjSVP完整的K域（BjSVP3）可独立作用于BoFLC，但K域亚域（K1、K2、K3）或者连接区（L1、L2）缺失突变后不能介导该作用。作用强度分析表明：BjSVP的I域能增强该蛋白互作，但M域和C域可能会干扰该作用；芥菜BiFLC被甘蓝BoFLC或BoFLCzq替换后，可明显增加作用强度；甘蓝FLC的I域第20位、K域第65位和C域第32位氨基酸的变异很可能与作用强度相关。; 汤青林刘智宇杨朴丽宋明王志敏; 关键词：芥菜甘蓝 FLC SVP 酵母双杂交

甘蓝抽薹开花抑制因子FLC与SVP体外表达及相互作用被引量：7: 2013年; 甘蓝抽薹开花抑制因子FLC与SVP可能存在相互作用,从而调节开花时间。为进一步的验证该相互作用,以甘蓝‘ZQ’为材料,扩增了594 bp的FLC cDNA和726 bp的SVP cDNA序列,它们分别编码197和241个氨基酸,且均属MIKC型蛋白。NCBI比对发现FLC与BoFLC3同源性高达98%,SVP与BoSVP-a同源性高达99%。将甘蓝FLC和SVP分别与原核表达载体pET43.1a融合,构建重组质粒pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP,并转化宿主菌大肠杆菌BL21,均能够在体外表达目的蛋白。利用免疫共沉淀的原理及pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP融合蛋白序列中的6×His标签能与Ni+结合的特点,结合SDSPAGE,检测到体外表达蛋白FLC与SVP能相互作用并形成复合体,这为深入研究FLC与SVP互作机理及探讨其与抽薹开花因子的相互作用提供了理论依据和技术基础。; 杨朴丽张丹华刘智宇许俊强王志敏汤青林宋明; 关键词：甘蓝 FLC SVP 体外表达蛋白质相互作用

结球甘蓝雌蕊调控转录因子SPT基因的克隆与序列分析被引量：1: 2013年; 以结球甘蓝E1为材料,提取花蕾总RNA,反转录cDNA。根据拟南芥SPT基因设计引物,采用同源克隆的方法从中克隆SPT基因序列1 085 bp,开放阅读框1 062 bp。通过cDNA推导得到的氨基酸序列分析表明,BoSPT编码353个氨基酸残基,预测分子量为37.67 kD,pI为6.83。经过EcoRⅠ和KpnⅠ限制酶双酶切后,构建原核表达质粒pET43.1a-BoSPT转化表达菌株E.coli Rosetta(DE3),通过SDS-PAGE检测该蛋白的表达。经Smart-embl预测其具有bHLH家族结构域,位于序列第173~221位氨基酸残基处。进化树表明结球甘蓝BoSPT与拟南芥AtSPT和筷子芥AlSPT的亲缘关系较近。BoSPT基因的原核表达得到纯化的融合蛋白。; 杨朴丽许俊强刘智宇王志敏张丹华汤青林宋明; 关键词：结球甘蓝雌蕊 SPT 基因克隆

甘蓝开花抑制因子FLC家族氨基酸序列差异及其对FLC/SVP聚合化的影响被引量：3: 2014年; 为深入研究甘蓝Flowering Locus C(FLC)家族与SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)蛋白互作的分子机理及其对开花的调控作用,从甘蓝‘ZQ-67’材料中克隆了5个FLC家族基因(记为BoFLCy1～BoFLCy5)。它们均编码MIKC型蛋白,按进化关系其编码蛋白可分为两类:BoFLCy3和BoFLCy5为第Ⅰ类,仅在C域有1个位点变异;BoFLCy1、BoFLCy2和BoFLCy4为第Ⅱ类,仅在K、C域分别有1、2个位点变异。酵母双杂交显示:甘蓝BoFLC家族蛋白均可与BoSVP蛋白互作;但BoFLCy4蛋白最为敏感,其N端插入3个氨基酸TET会破坏该作用。β–半乳糖苷酶活性分析表明:BoFLCy1～BoFLCy5与BoSVP互作强度差异显著,强弱关系为:BoFLCy1>BoFLCy2>BoFLCy3>BoFLCy5>BoFLCy4,该家族蛋白KC域内的变异位点若为疏水氨基酸则有利于FLC/SVP聚合。进一步分析突变BoFLCy4蛋白IK域内的保守位点发现:蛋白作用强度可能不受I域的这些保守性亲(疏)水氨基酸(第63、77位)影响,而会受到K域保守氨基酸(第120、121、135、157位)的亲(疏)水性调节。; 刘智宇杨朴丽江为谷慧英王志敏宋明汤青林; 关键词：甘蓝 FLC SVP 酵母双杂交

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杨朴丽