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表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27000外膜蛋白的重组卡介苗构建被引量：3: 2005年; 　目的:构建能够表达胞壁结合型贝氏柯克斯体 27 000外膜蛋白的重组卡介苗。方法:用PCR技术从卡介苗基因组扩增分枝杆菌 19 000抗原的细胞壁结合区基因和从贝氏柯克斯体基因组扩增 27 000外膜蛋白基因,将它们分别插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒 (pSMT3)的XbaⅠ /BamHⅠ和BamHⅠ /HindⅢ位点。将重组的穿梭质粒转化大肠杆菌并从大肠杆菌提取重组穿梭质粒转化卡介苗。结果:从含潮霉素的培养基筛选到具有该抗生素抗性的重组卡介苗菌落,用免疫印迹分析重组质粒转化的卡介苗,发现一约 27 000的蛋白带与贝氏柯克斯体 27 000重组蛋白免疫兔血清发生特异性反应; 27 000重组蛋白免疫兔血清做间接免疫荧光检测重组卡介苗,结果为阳性。结论:重组卡介苗能表达贝氏柯克斯体 27 000外膜蛋白,表达的 27 000外膜蛋白存在于卡介苗菌体表面,卡介苗菌体表面的 27 000抗原可能诱导抗Q热免疫应答。; 牛东升温博海邱玲陈梅玲李青凤; 关键词：贝氏柯克斯体外膜蛋白卡介苗穿梭质粒基因表达

贝氏柯克斯体感染与免疫的研究: 贝氏柯克斯体是一种嗜单核一巨噬细胞寄生的革兰阴氏性小球杆菌,为Q热的病原和潜在生物恐怖剂。将贝氏柯克斯体与人单核细胞(THP-1)在体外共同培养,结果发现人单核细胞对活贝氏柯克斯体的吞噬效率则显著低于对Ξγ射线灭活贝氏柯...; 温博海孙长俭李青凤李丽莉; 关键词：贝氏柯克斯体细菌感染免疫功能; 文献传递

贝氏柯克斯体外膜蛋白与热休克蛋白融合蛋白的研制及其免疫原性的研究: 贝氏柯克斯体是一种专性细胞内寄生菌，为重要人畜共患病Q热的病原体，也是一种重要的生物战剂和生物恐怖剂。Q热疫苗接种是预防贝氏柯克斯体感染的最有效的措施。采用基因工程技术制备重组保护性抗原是研制Q热分子疫苗的重要手段。 ...; 李青凤; 关键词：贝氏柯克斯体融合蛋白免疫原性免疫保护性 Q热疫苗分子疫苗; 文献传递

实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体被引量：13: 2006年; 目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-ti me PCR)方法。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999)。荧光定量PCR检测恙虫病东方体的灵敏度约为套式PCR的100倍,并且具有良好的重复性。用该定量PCR检测其它相关立克次体和病原菌DNA样本,检出结果均为0。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肺脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体出现最早和检出量最多,肝脏和肺脏次之。血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于东方体感染早期血样本的快速检测作恙虫病感染早期诊断,并且可以定量分析评价恙虫病东方体感染的程度。; 朱丽娜张晶波陈梅玲温博海牛东升李青凤孙长俭杨晓; 关键词：恙虫病东方体实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR检测普氏立克次体被引量：6: 2006年; 目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测普氏立克次体的实时荧光定量PCR方法。方法根据普氏立克次体外膜蛋白B的基因(ompB)序列设计引物和探针,以克隆的OmpB基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI 7900型)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0．999)；与巢式PCR相比较,荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测莫氏立克次体及其他相关立克次体和细菌DNA,检出结果均为阴性。用荧光定量PCR检测普氏立克次体感染的豚鼠血标本,某些样本检测为阳性,而用巢式PCR检测的结果均为阴性。结论研究中建立的检测普氏立克次体实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,适合于快速检测样本中微量普氏立克次体DNA,可用作临床实验室快速确诊流行性斑疹伤寒。; 杨晓陈梅玲温博海牛东升朱丽娜李青凤孙长俭; 关键词：流行性斑疹伤寒普氏立克次体实时定量PCR

立氏立克次体外膜蛋白B基因的克隆与表达及其免疫原性的研究: 立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)是落基山斑点热(RMSF)的病原体,为专性细胞内寄生的小革兰氏阴性菌,人对其十分易感。外膜蛋白B(OmpB)是立氏立克次体最主要的表面蛋白抗原,被认为是发展落基山...; 牛东升陈梅玲李青凤温博海; 关键词：斑点热病原体免疫原性基因克隆; 文献传递

立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立被引量：7: 2006年; 目的采用TaqMan-MGB探针建立立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法。方法依据立氏立克次体外膜蛋白B基因序列设计引物和探针,以克隆的ompB基因片段为DNA模板,在ABI 7900型荧光定量PCR检测仪上建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的定量标准曲线Ct值与模板拷贝数呈线性关系(R2=0．996),最低检测浓度为5拷贝／μl;用荧光定量PCR方法检测其他相关立克次体和常见非立克次体病原菌,检出结果均为阴性。用该方法检测立氏立克次体感染的豚鼠血液标本、小鼠脾脏标本及细胞培养标本,检测的结果与立氏立克次体感染相关。结论研究建立的检测立氏立克次体实时荧光定量PCR方法具有高特异性和高敏感性,适用于快速检测各种样本中的立氏立克次体和立氏立克次体感染早期的实验室诊断。; 牛东升陈梅玲温博海李青凤邱玲张晶波; 关键词：敏感性特异性

氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体残存组分Q热疫苗的免疫原性及免疫保护性研究被引量：6: 2007年; 目的实验评价氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体残存组分(CMR)疫苗的免疫特性及免疫保护性。方法采用国内分离贝氏柯克斯体新桥株制备CMR疫苗,用CMR免疫Balb/c小鼠;采用间接免疫荧光法检测CMR免疫小鼠血清特异性抗体水平和用淋巴细胞增殖试验评价CMR疫苗体外刺激小鼠脾细胞增殖的能力;以贝氏柯克斯体攻击免疫小鼠和用贝氏柯克斯体特异的荧光定量PCR检测感染小鼠血和脾脏样本。结果CMR免疫第4周起,小鼠血清中检出高水平的特异性抗体,CMR加氢氧化铝佐剂免疫小鼠的血清特异性抗体显著高于未加佐剂组。CMR在体外刺激正常小鼠和免疫小鼠脾淋巴细胞增殖水平显著高于对照组,WCV则抑制正常脾淋巴细胞增殖。三种剂量(30μg、10μg、1μg/只)CMR免疫小鼠血和脾脏样本贝氏柯克斯体含量显著低于未免疫组,以30μg组及加佐剂免疫小鼠的样本含菌量更显著低于对照组。结论采用我国分离株制备的CMR疫苗能诱导机体产生高效特异性体液免疫和细胞免疫应答,使机体抵抗大剂量的贝氏柯克斯体感染,具有良好的免疫原性和免疫保护性;氢氧化铝佐剂能显著增强CMR疫苗的免疫保护效能。; 孙长俭陈梅玲杨晓温博海牛东升李青凤王锡乐; 关键词：贝氏柯克斯体 Q热疫苗

表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白的重组卡介苗构建: 2004年; 　　构建能够表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白的重组卡介苗.用PCR技术从卡介苗(BCG)基因组扩增分支杆菌19kDa抗原的细胞壁结合区基因和从贝氏柯克斯体基因组扩增27kDa外膜蛋白基因,将它们分别插入大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒(pSMT3)的XbaⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/HindⅢ位点.将重组的穿梭质粒转化大肠杆菌和从大肠杆菌提取重组穿梭质粒转化卡介苗.从含潮霉素的培养基筛选到具有该抗生素抗性重组卡介苗菌落,用免疫印迹分析重组质粒转化的卡介苗,发现一约27kD的蛋白带与贝氏柯克斯体27kD重组蛋白免疫兔血清特异反应,用27kD重组蛋白免疫兔血清做间接免疫荧光检测重组卡介苗,结果为阳性.重组卡介苗能表达贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白,表达的27kDa外膜蛋白存在卡介苗菌体表面,卡介苗菌体表面的27kD抗原可能有效地诱导特异性的抗Q热免疫应答.……; 牛东升温博海邱玲陈梅玲李青凤

贝氏柯克斯体表面抗原基因p1与hspB的融合基因在大肠杆菌中的表达: 2004年; 目的将贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)表面抗原P1蛋白基因与热休克蛋白B(HspB)基因片段融合,并使该融合基因在大肠杆菌细胞内表达,产生P1-HspB融合蛋白.方法采用PCR方法,从贝氏柯克斯体新桥株基因组DNA中扩增P1蛋白基因(p1)和HspB蛋白基因(hspB)片段,将两基因片段分别与原核表达载体pQE30连接,分别构建重组表达质粒pQE30/ p1和pQE30/hspB.用BamHI 和SacI DNA内切酶将p1基因片段从pQ E30/p1切下并与pQE30/hspB的hspB连接,构建重组质粒pQE30/p1-hspB. 用IPTG诱导pQE30/p1-hspB转化的大肠杆菌表达融合基因p1-hspB.结果 SDS-PAGE分析发现pQE30/p1-hspB转化的大肠杆菌表达一83 kDa融合蛋白;经薄层扫描分析,该融合蛋白约占到全菌体蛋白的12.1%;免疫印迹分析发现该融合蛋白能被贝氏柯克斯体感染小鼠血清所识别.结论构建的p1-hspB融合基因在大肠杆菌中得到了有效表达,表达的P1-HspB融合蛋白能与抗贝氏柯克斯体抗体特异反应,P1-HspB融合蛋白为Q热亚单位疫苗的研制提供了一种新型融合蛋白.; 李青凤牛东升温博海邱玲陈梅玲

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