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小鼠髓源性树突状细胞的体外扩增及生物学特性的鉴定被引量：1: 2010年; 目的以小鼠骨髓细胞为前体,建立一种高效、简便的体外扩增、分离培养树突状细胞(DC)的方法。方法实验分为GM/4组和GM/4-α组,以重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组鼠白介素-4(rmIL-4)对小鼠骨髓细胞联合诱导培养,GM/4-α组在第5天添加rmTNF-α继续培养48 h,GM/4组不加并于第5天时终止培养;分别收集第5天、第7天的悬浮及疏松贴壁细胞,扫描电镜观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞表面分子,同种异体混合淋巴细胞反应(MLR),检测2组细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果所收集的2组细胞均具有典型DC形态,细胞表面高表达小鼠髓源性DC相对特异性标志CD11c,表达率达75%以上;GM/4组DC细胞表面CD40、CD86、MHC-Ⅱ的表达率分别为30.5%、34.2%、45.1%,GM/4-α组则分别为78.7%、88.3%、96.7%;MIR中GM/4组DC刺激同种异体T细胞活化增殖的能力不如GM/4-α组强。结论此种方法能于体外定向诱导和扩增出大量髓源性DC,这为后续研究DC在器官移植后诱导机体免疫耐受的机制奠定了基础。; 余昆苟欣周青松杨华安仲伟营夏阳; 关键词：树突细胞免疫耐受小鼠

C_(57)BL小鼠survivin基因miRNA表达载体的构建被引量：2: 2009年; 背景:Survivin在多种肿瘤组织中的高表达,具有调节细胞增殖分裂和强大的抗凋亡功能。目的:利用RNA干扰技术,构建具有特异性阻断C57BL小鼠survivin基因的微小RNA(micro RNA,miRNA)表达载体。设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-06/11在重庆医科大学附属第一医院神经内科实验中心完成。材料:环形pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR和BLOCK-iTTM PolII miR RNA干扰Expression Vector Kit with EmGFP为Invitrogen公司产品;DH5a大肠杆菌为实验室保存;xhoI和BamHI酶、壮观霉素均为上海生工生物工程有限公司产品。方法:应用设计软件在C57BL小鼠survivin基因的mRNA上寻找特异性的短核苷酸序列,并设计合成4对寡核苷酸序列,经退火后形成双链DNA片段,采用基因克隆技术,将其克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR的载体中,转化DH5a大肠杆菌,挑单菌落种于含有壮观霉素LB液体培养基中,提取质粒。主要观察指标:应用测序法和琼脂糖电泳检测对重组体进行鉴定。结果:测序结果显示插入片段与线性载体连接正确,无碱基突变、缺失、插入等异常。双酶切处理pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR重组质粒结果显示片段大小与预期相符。结论:实验结果表明成功构建了C57BL小鼠survivin基因的微小RNA表达载体。; 王海峰苟欣黎衍敏何卫阳杨华安; 关键词：C57BL小鼠 MIRNA SURVIVIN

树突状细胞诱导的器官移植后免疫耐受被引量：1: 2009年; 树突状细胞(dendritic cell,DC)是当前发现的功能最强的专职抗原提呈细胞(antigen-presenting cell,APC),其作为机体适应性T细胞免疫应答的始动者和调控者,已成为目前器官移植领域的研究热点。本文就树突状细胞的生物学特性、体外扩增培养、诱导移植免疫耐受的机制等方面的研究进展做一综述。; 余昆苟欣; 关键词：树突状细胞器官移植免疫耐受

Survivin在小鼠髓源性树突状细胞不同分化阶段中的差异性表达被引量：1: 2010年; 目的:探讨不同分化阶段的树突状细胞(DC)sur-vivin的差异性表达。方法:制备骨髓细胞作为DC前体,以rmGM-CSF联合rmIL-4对前体细胞诱导培养,第5天时添加rmTNF-α继续孵育48 h以进一步刺激DC分化成熟。分别收集0、5、7 d的细胞(其中第5天的细胞为添加rmTNF-α前收集),扫描电镜观察DC形态、流式细胞术鉴定DC表型,RT-PCR、Western blot检测不同分化阶段DCsurvivin的表达。结果:扫描电镜下不同分化阶段的细胞均具有典型DC形态;流式细胞术分析表明,不同成熟阶段的DC均高表达小鼠髓源性DC相对特异性标志CD11c,经rmTNF-α刺激后的DC其细胞表面CD40、CD86、MHC-Ⅱ等分子呈高水平表达;RT-PCR、Western blot检测结果显示,随着DC的分化成熟,sur-vivinmRNA及蛋白的表达水平呈上升趋势。结论:不同诱导条件下,获得的DCsurvivin表达有差别,随着DC成熟,sur-vivin表达增加。; 余昆苟欣杨华安周青松仲伟营郑军; 关键词：SURVIVIN 树突状细胞免疫耐受骨髓

Survivin表达对鼠髓样树突状细胞成熟的影响: 2009年; 目的:探讨survivin的表达变化对小鼠骨髓来源树突状细胞分化成熟的影响。方法:无菌条件下取小鼠的骨髓细胞作为树突状前体细胞,用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和白细胞介素4(Interleukin 4,IL-4)的培养基定向诱导树突状前体细胞分化成未成熟树突状细胞(Immatureden driticcells,iDC),用GM-CSF,IL-4及肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)定向诱导树突状前体细胞分化成成熟树突状细胞(Matureden driticcells,mDC):运用半定量RT-PCR,Westernblot比较树突状前体细胞、iDC与mDC中survivinm RNA、survivin蛋白的含量变化。结果:RT-PCR检测结果显示,树突状前体细胞survivinmRNA表达值为(0.735±0.081),iDC为(0.596±0.073,P<0.05),mDC为(0.393±0.052,P<0.01);Westernblot检测结果显示:树突状前体细胞survivin蛋白的表达值为(0.767±0.045),iDC的表达值为(0.396±0.016,P<0.05),mDC的表达值为(0.168±0.009,P<0.01)。结论:survivin在树突状前体细胞中高表达,在iDC与mDC中表达量略低;且survivin在iDC中的表达量高于mDC,这个结论为我们的后续实验提供了理论基础。; 黎衍敏苟欣何卫阳王海峰; 关键词：树突状细胞 SURVIVIN 分化

小鼠survivin基因重组真核表达载体的构建及鉴定被引量：2: 2009年; 目的:应用质粒pEGFP-N1构建含小鼠survivin基因的重组真核载体。方法:采用Oligo核酸软件对Genbank上所发表的小鼠survivin mRNA序列进行分析,自行设计一对分别含有HindⅢ、BamHⅠ酶切位点的survivin基因上下游引物,利用PCR扩增出该基因的全序列cDNA,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP-N1/survivin重组真核表达载体。然后通过卡那霉素抗性筛选、双酶切及PCR鉴定,选取鉴定正确的克隆测序。结果:双酶切与测序结果表明目的基因序列克隆正确,成功构建了含有小鼠survivin基因的重组真核表达载体。结论:重组真核表达载体pEGFP-N1/survivin构建成功,为下一步研究sur-vivin在未成熟树突状细胞中诱导分化与致耐受作用奠定基础。; 余昆苟欣杨华安周青松夏阳; 关键词：SURVIVIN PEGFP-N1 未成熟树突状细胞

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国家自然科学基金(30772043)