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从Raji细胞克隆IL-10基因: 2007年; [目的]探索一种简便可行的白细胞介素-10(IL-10)基因的克隆方法。[方法]以人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji细胞为材料,提取培养的Raji细胞中的总RNA。根据GenBank中人IL-10基因序列设计1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增人IL-10基因的编码cDNA。回收目的片段,将其与pMD18-T载体连接并转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α,构建该基因的重组质粒。重组质粒经PCR和双酶切鉴定后进行测序。[结果]以骨髓细胞组织总RNA为模板进行RT-PCR,可从Raji细胞中获得了预期的约550bp特异性条带。成功构建了IL-10基因的重组质粒,PCR扩增和双酶切的鉴定结果说明该插入片段可能为IL-10cDNA。从获得的阳性克隆中挑选1个菌落来分析重组质粒的插入DNA片段序列。序列分析结果证实其与报道的IL-10基因的序列一致。[结论]该研究为IL-10的重组表达及其生物学活性分析奠定了基础。; 陈其新劳风学李明; 关键词：IL-10 克隆

牛生长激素基因工程菌的构建及其诱导表达被引量：3: 2008年; 为获得牛生长激素(BST)蛋白,构建了工程菌并进行了诱导表达.先设计2对引物,从pUCm-T-BST克隆中扩增出BST成熟蛋白编码序列,双酶切后分别插入表达载体(pET30 a和pET29 a),转化E.coliDH5α并进行阳性克隆鉴定;再将重组质粒分别转化到E.coliBL21(DE3)和RosettaTM(DE3)pLysS中,构建BST原核工程菌;最后进行诱导表达.结果表明,重组表达载体pET30 a-BST和pET29 a-BST中均插入了正确的目的基因;经IPTG诱导后,以BL21(DE3)为宿主的工程菌无目的蛋白表达,而pET30 a-BST/RosettaTM和pET29 a-BST/RosettaTM分别可见分子量约29.5,26.5 kD的融合蛋白表达,约占菌体蛋白的26%,35%.说明稀有密码子限制BST基因在E.coli中的表达,选择适宜的宿主菌可克服此障碍.; 石晓卫陈其新王凤云李明赵巧辉刘孟洲; 关键词：牛生长激素蛋白质克隆

家兔BMP7基因3′UTR的克隆及序列分析被引量：5: 2009年; 【目的】研究家兔BMP7基因3′非翻译区(3′UTR)序列的结构及功能特点。【方法】以家兔肾脏组织为材料,应用3′RACE技术对家兔BMP7基因3′UTR序列进行扩增,并与GenBank中登陆的其他哺乳动物相应序列进行比较分析。【结果】成功克隆了家兔BMP7基因的3′UTR(GenBank号:EU004072);在3′UTR序列末端存在2个切割与胞质多聚腺苷化特异因子(CPSF)结合位点(AAUAAA)和1个11 bp的poly(A)。家兔BMP7基因3′UTR序列与小鼠、人、牛和猪的一致性分别为41.45%,50.30%,47.84%和57.91%,相对不保守。【结论】家兔BMP7基因3′UTR结构特点可能与其基因功能有关。; 赵巧辉陈其新李明石晓卫刘孟洲; 关键词：家兔

黄淮山羊Leptin cDNA的克隆及鉴定被引量：3: 2007年; 根据GenBank中公布的山羊Leptin基因部分基因组核苷酸序列,设计合成一对引物,以山羊脂肪组织总RNA为模板,采用RT-PCR法,扩增出Leptin成熟蛋白编码cDNA序列,将此扩增产物克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切鉴定及序列测定与分析。结果表明,扩增的山羊Leptin基因编码序列长为441bp,编码146个氨基酸。同源性分析表明,山羊Leptin基因成熟蛋白编码cDNA与小鼠、人、猪、牛及绵羊基因相应序列的同源性分别为82.22%、87.76%、92.97%、96.15%和98.64%,氨基酸同源性为84.25%、86.99%、92.47%、97.95%和100.00%,说明Leptin是一组在进化上高度保守的蛋白质。山羊Leptin成熟蛋白cDNA的成功克隆,为进一步研究黄淮山羊Leptin基因全结构、基因表达与调控奠定了基础。; 陈其新李明石晓为赵巧辉; 关键词：LEPTIN 山羊克隆

黄淮山羊骨形态发生蛋白4(BMP4)基因的克隆及优化表达被引量：1: 2010年; 根据GenBank公布的人和牛BMP4基因序列设计引物,通过RT-PCR和PCR方法分别扩增全长编码序列和内含子2、3,进行克隆及测序鉴定;根据已得到的序列设计引物扩增BMP4成熟蛋白cDNA,克隆入pET32a表达载体,转化E.coliBL21(DE3)plysS进行诱导表达,同时进行诱导条件的优化。结果显示,山羊BMP4基因全编码序列、内含子2和3序列长度分别为1 230、1 053、962 bp,与猪、人、小鼠和牛相应序列的同源性分别为:96.10%、94.96%、91.79%、99.19%,83.80%、76.03%、66.94%、96.71%和87.15%、80.24%、67.20%、98.13%。在E.coliBL21(DE3)plsS中表达的BMP4融合蛋白的相对分子量为31 000,适宜的诱导条件为:0.5 mmol/L IPTG、22℃、诱导8 h.结果表明,黄淮山羊BMP4基因全长编码序列和内含子2、3已被成功克隆。适宜表达条件的确定为进一步研究山羊BMP4的生物学功能奠定了基础。; 李明石晓卫陈其新张弛周建设刘孟洲赵巧辉; 关键词：黄淮山羊 BMP4

家兔BMP7基因的克隆及其生物信息学分析被引量：7: 2008年; 在对已知部分编码序列(CDS)进行分析的基础上,采用RT-PCR分步扩增以及RACE方法,对家兔BMP7基因3′和5′末端未知序列进行了克隆与生物信息学分析。测序结果综合分析表明,所获序列共计1654bp,包括家兔BMP7近全长前肽、全长成熟肽CDS及3′非翻译序列(3′UTR),将已有的序列向5′和3′端分别延伸了395bp和628bp。序列对比表明,克隆的家兔BMP7 CDS部分与人、小鼠的对应序列的同源性分别为91.89%和89.32%,预测的氨基酸序列同源性分别为96.51%和96.01%。家兔BMP7 3′UTR长446bp,与人、小鼠对应序列同源性分别为57.38%和45.57%;具有2个转录终止信号位点。推测家兔BMP7成熟蛋白有BMPs特有的7个位置固定的半胱氨酸残基和TGF-β家族指纹。家兔BMP7 3′UTR区转录终止信号的可选择性可能与基因转录后调控有关。; 李明赵巧辉陈其新刘孟洲石晓卫; 关键词：家兔 BMP7 克隆生物信息学分析

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河南省教育厅自然科学基金(2007230003)