王金良
- 作品数：12 被引量：21H指数：3
- 供职机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技支撑计划中央级公益性科研院所基本科研业务费专项更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 红色荧光示踪狂犬病病毒ERA株病毒粒子方法的建立
- 2018年
- 为建立一种狂犬病病毒(RABV)荧光标记方法,便于有效地观察研究RABV侵入细胞及脱壳的过程,本研究采用CY5-NHS酯红色荧光染料标记氨基的方法将纯化的RABV ERA株进行CY5-NHS酯荧光染料标记;采用亲脂性羰花青荧光染料将细胞膜染成绿色;采用DNA荧光染料将细胞核染成亮蓝色;在3D活细胞激光共聚焦分析成像系统下成像,动态观察病毒吸附细胞并内吞的过程。与传统的染色方法相比,本研究建立的病毒标记方法更适合在3D活细胞激光共聚焦分析成像系统下观察和拍摄RABV感染细胞的过程,为RABV感染机制的研究提供了一种有效研究方法,对于其它弹状病毒科病毒标记方法的建立也具有一定的参考意义。
- 单博文王金良刘仁强帅磊王喜军葛金英温志远夏咸柱步志高
- 关键词：狂犬病病毒活细胞成像
- 埃博拉和马尔堡病毒囊膜糖蛋白嵌合型重组水泡性口炎病毒的构建及鉴定被引量：4
- 2016年
- 埃博拉病毒(EBOV)和马尔堡病毒(MARV)属于丝状病毒科,能够导致人和动物发生致命的埃博拉出血热和马尔堡出血热,这两种病是重要的尚未传入我国的烈性人兽共患病。为研制安全有效的储备疫苗,本研究利用水泡性口炎病毒(VSV)反向遗传操作技术,将VSV自身糖蛋白(GP)分别替换为EBOV或MARV的GP,构建了表达扎伊尔型EBOV、苏丹型EBOV及MARV GP的嵌合VSV重组病毒r VSV△G/ZEBOVGP、r VSV△G/SEBOVGP及r VSV△G/MARVGP。Western blot和间接免疫荧光试验表明这3种GP蛋白在重组病毒感染的细胞中均能够正确表达。电镜观察结果显示,3种重组病毒均与亲本病毒具有相同形态特征,表明这3种外源GP蛋白均能够嵌合在重组病毒粒子表面。本研究构建的这3种重组病毒为进一步的动物免疫试验并评价其免疫效果奠定了基础。
- 邵钰王金良刘任强张会雷王喜军葛金英温志远步志高
- 关键词：埃博拉病毒马尔堡病毒囊膜糖蛋白水泡性口炎病毒
- AP2M1在狂犬病病毒侵入中的作用研究被引量：3
- 2019年
- 本研究前期利用RNA干扰技术在人类全基因组水平上筛选到了与狂犬病病毒(RABV)生命周期有关的宿主基因AP2M1。为进一步研究AP2M1影响RABV感染的机制,本实验在人胚胎肾细胞(HEK-293)中沉默或过表达AP2M1,采用高内涵筛选、病毒滴度检测等方法分析AP2M1对RABV感染率的影响。结果显示:敲低AP2M1,RABV感染率显著下降;过表达AP2M1,RABV感染率上升。酸绕过实验显示AP2M1在RABV感染过程中发挥作用。激光共聚焦观察显示RABV G蛋白与AP2M1无共定位。免疫共沉淀实验显示AP2M1与RABV G蛋白无直接相互作用。本研究结果表明,AP2M1基因在RABV感染过程中发挥作用,但不是通过与RABV G蛋白的直接作用影响病毒的感染。本研究为阐明AP2M1在RABV生命周期中具体作用奠定了基础。
- 马骁王翀王金良王子龙王鑫鑫帅磊王喜军葛金英温志远步志高
- 关键词：狂犬病病毒G蛋白
- 表达山羊SLAM受体的重组腺病毒的构建及在增强PPRV感染羊源原代细胞中的应用被引量：1
- 2020年
- 由于目前用于小反刍兽疫病毒(PPRV)相关研究的羊源细胞均为原代细胞,其对PPRV的敏感性较差,而信号淋巴细胞激活分子(SLAM)作为PPRV的重要受体可以促进病毒的感染与复制。因此,为构建表达山羊SLAM(gSLAM)的重组腺病毒,为羊源原代细胞提供SLAM受体,本研究将gSLAM基因克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,转化至含有5型腺病毒骨架的BJ5183感受态细胞中,获得重组腺病毒载体pAd-gSLAM,转染293A细胞,经PCR鉴定表明获得了重组腺病毒rAd-gSLAM。以MOI 3 rAd-gSLAM感染Vero细胞后,采用western blot检测SLAM的表达。结果显示,rAd-gSLAM能够感染Vero细胞并表达SLAM蛋白。将PPRV疫苗株rPPRV/GFP和中国流行株PPRV/CN/HLJ/13分别以MOI 0.1感染rAd-gSLAM预先感染后的Vero(Vero/rAd-gSLAM)细胞,24 h经荧光显微镜观察,并采用荧光定量PCR检测两株病毒在感染后不同时间点的拷贝数,绘制病毒的生长曲线。荧光显微镜观察可见,rPPRV/GFP感染的Vero/rAd-gSLAM细胞出现较大量绿色荧光且形成明显的细胞融合;PPRV/CN/HLJ/13感染的Vero/rAd-gSLAM细胞形成明显的细胞融合且出现红色荧光。病毒的生长曲线结果显示,rPPRV/GFP在Vero/rAdgSLAM细胞中的拷贝数与其在Vero和Vero/Ad对照细胞中的拷贝数在感染后各时间点差异却均不显著;PPRV/CN/HLJ/13的拷贝数在感染Vero/rAd-gSLAM细胞后24 h即达到峰值,且其在感染该细胞后72 h的拷贝数约为其感染Vero及Vero/Ad细胞在该时间点的48倍。将rAd-gSLAM(MOI 3)感染原代羊源睾丸(LT)细胞后,再以MOI 0.1分别感染rPPRV/GFP和PPRV/CN/HLJ/13,72 h后经荧光显微镜观察可见,前者感染的LT细胞出现绿色荧光,且有明显的细胞融合;后者感染的LT细胞出现明显的细胞融合和CPE。上述结果表明,本研究构建了表达gSLAM的重组腺病毒rAd-gSLAM,其感染Vero细胞系和原代LT细胞后均能够表达gSLAM,增强了PPRV对Vero细胞系和原代LT细胞的感染与复制。本研究为PP
- 陈合凤张帅王喜军王金良温志远葛金英陈伟业步志高
- 关键词：小反刍兽疫重组腺病毒VERO
- 融合域点突变的埃博拉病毒GP蛋白重组新城疫病毒的构建与免疫评价
- 2021年
- 扎伊尔型埃博拉病毒(EBOV)的感染会引起人类以严重出血和发热为主要症状的传染病,死亡率高达90%,对公共卫生构成严重威胁。EBOV囊膜蛋白(GP)是病毒主要的免疫原性蛋白。本团队前期的研究表明,以新城疫病毒(NDV)为载体构建表达EBOV GP蛋白的重组病毒rLa-EBOVGP改变了NDV的侵入方式。为了研制出安全性更高的埃博拉候选疫苗株,本研究将EBOV GP蛋白的融合域I532突变为R后插入NDV LaSota疫苗株(rLa)基因组中,通过反向遗传学操作拯救表达EBOV GP(I532R)蛋白的重组NDV,并将经PCR鉴定正确的重组病毒在鸡胚中连续传代检测了其的体外遗传稳定性。RT-PCR鉴定结果显示,EBOV突变的GP(I532R)蛋白基因正确插入了NDV基因组中,表明获得了重组病毒rLa-EBOVGP(I532R);在鸡胚中连续传20代后,经RT-PCR扩增EBOV GP(I532R)基因后经测序鉴定,结果显示rLa-EBOVGP(I532R)能够保持良好的遗传稳定性。利用蔗糖梯度超速离心法纯化rLa、rLa-EBOVGP和rLa-EBOVGP(I532R)病毒,分别进行western blot检测。结果显示,EBOV GP和GP(I532R)蛋白均能够正确表达;将rLa、rLa-EBOVGP和rLa-EBOVGP(I532R)分别感染BHK-21细胞后,利用激光共聚焦试验分析EBOV GP(I532R)的表达和定位,结果显示GP(I532R)能够表达且位于BHK-21细胞的细胞膜上;对纯化病毒利用免疫电镜观察病毒颗粒,结果可见rLa-EBOVGP(I532R)与亲本病毒rLa结构特征相似,且GP(I532R)蛋白能够嵌合在重组病毒粒子表面;生长动力学试验结果表明,rLa-EBOVGP(I532R)与亲本株rLa在鸡胚中的生长特性基本一致,且能够稳定增殖;分别将重组病毒rLa-EBOVGP和rLa-EBOVGP(I532R)经肌肉注射和滴鼻两种途径免疫小鼠,经稀释血清固定病毒的方法分别检测各组小鼠针对NDV和EBOV GP蛋白的中和抗体。结果显示rLa-EBOVGP(I532R)能够诱导小鼠产生较高的针对NDV和EBOV GP蛋白的中和抗体。以上结果表明rLa-EBOVGP(I532R)具有作为防控EBOV感染的储备性�
- 张海琳王金良王翀温志远刘任强步志高葛金英
- 关键词：重组新城疫病毒
- 紫外线抵抗相关基因UVRAG影响狂犬病病毒感染机制的研究
- 2021年
- 为研究宿主因子紫外线抵抗相关基因(UVRAG)影响狂犬病病毒(RABV)感染的机制,本研究在HEK293细胞中干扰或过表达UVRAG后感染表达mCherry蛋白的重组RABV(rERA-mCherry),于感染后不同时间(24 h、48 h、72 h、96 h)检测上清中病毒的滴度并绘制病毒的生长曲线。结果显示,与转染对照siControl的细胞相比,干扰UVRAG的表达再感染RABV后不同时间细胞上清中的病毒滴度均显著降低(p<0.01),表明干扰UVRAG的表达后抑制RABV的复制能力;而过表达UVRAG后则不影响RABV的增殖能力。干扰293细胞中UVRAG的表达后分别感染表达RABV G蛋白的重组VSV(rERA-G-VSV)及VSV,6 h后利用q PCR方法检测各细胞中的病毒拷贝数。结果显示,与未干扰的细胞相比,干扰UVRAG表达后细胞中rERA-G-VSV基因拷贝数极显著下降(p<0.001);但干扰或者未干扰细胞中VSV基因拷贝数则无显著差别。表明RABV G蛋白是rERA-G-VSV在干扰UVRAG表达细胞中增殖下降的原因且UVRAG影响RABV感染的早期侵入阶段。干扰293细胞中UVRAG表达后感染rERAmCherry,利用酸绕过试验进一步分析RABV感染的阶段;上述干扰细胞感染rERA-mCherry后不同时间点(0、1.5 h、6 h)利用qPCR方法检测病毒基因拷贝数,分析UVRAG影响RABV侵入的具体阶段。酸绕过试验结果显示,经pH7.5的PBS处理后,干扰组的细胞相对于未干扰组细胞中RABV基因拷贝数极显著下降(p<0.001);但pH5.5的酸性PBS处理后两组转染细胞中的病毒拷贝数无显著差异。进一步证明UVRAG在RABV感染早期的侵入阶段发挥重要作用。不同时间点病毒基因拷贝数的qPCR检测结果显示,病毒感染后0、1.5 h两种转染细胞中的病毒拷贝数均无显著差异,但在感染病毒6 h时干扰组的细胞相比于未干扰组的细胞中病毒的拷贝数显著降低(p<0.01)。表明UVRAG影响病毒的胞内运输阶段。利用免疫共沉淀试验(Co-IP)检测UVRAG及其不同结构域蛋白与RABV受体一代谢型谷氨酸受
- 何倩倩王鑫鑫罗杰温志远王金良步志高
- 关键词：狂犬病病毒
- 表达西尼罗病毒囊膜糖蛋白PrM/E重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究
- 2015年
- 西尼罗病毒(WNV)是一种可以导致人与动物死亡的人兽共患病的虫媒病毒。为构建表达WNV Pr M/E蛋白的重组新城疫病毒(NDV)La Sota疫苗株并对其免疫原性进行评价,本研究利用反向遗传学操作技术将人工合成的WNV pr M/E基因插入至NDV基因组P和M基因之间,构建重组病毒r La-WNV-Pr M/E。以重组病毒分别感染BHK-21细胞和免疫小鼠,利用RT-PCR、间接免疫荧光、ELISA和流式细胞术(FACS)检测Pr M/E蛋白的表达情况及免疫效果。结果显示,WNV-Pr M/E蛋白在BHK-21细胞中获得正确表达,免疫小鼠可以诱导其产生高水平的抗Pr M/E蛋白特异性Ig G,并且诱导产生WNV E蛋白表位特异性CD4+和CD8+T细胞免疫反应。以上结果表明本研究构建的r La-WNV-Pr M/E可以作为一种具有前瞻性和储备性且安全有效的西尼罗热防控候选疫苗,对我国应对该病的潜在威胁具有十分重要的意义。
- 杨洁温志远葛金英王金良华荣虹邵钰步志高
- 关键词：西尼罗病毒重组新城疫病毒
- H9N2亚型禽流感病毒的序列分析及对哺乳动物致病力研究被引量：5
- 2013年
- 为研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)对哺乳动物的致病力,本研究选取了2009年～2010年从我国南方地区分离到的6株H9N2 AIV,测定分析了其基因组序列及在小鼠体内的复制能力。HA基因分析显示:6株病毒均属于A/CK/BJ/94谱系,HA均含有人样受体结合位点Leu226。PB2基因分析表明,6株H9N2 AIV分离株均具有AIV低致病力的分子特征(Glu627和Asp701)。对BALB/c小鼠感染试验显示:感染组无任何临床症状及增重;病毒仅局限于小鼠呼吸道复制。本研究结果有助于全面了解近年我国H9N2 AIV分子进化情况,并对评估H9N2AIV对哺乳动物的潜在威胁提供参考。
- 王金良李旭勇范俊郭晶邓国华施建忠陈化兰
- 关键词：H9N2亚型禽流感病毒小鼠
- H7N9亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立及其疫苗候选株的构建被引量：2
- 2014年
- 为建立H7N9亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究以H7N9亚型(AIV)A/CK/Shanghai/S1053/2013(CK/53)株为亲本病毒,构建了该病毒株的8质粒反向遗传操作系统,并拯救出救获株rCK/53。全基因组序列测定结果表明,rCK/53与亲本病毒的核苷酸序列完全一致。同时以A/PueaoRico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以CK/53的HA和NA的表面基因为供体,构建H7N9亚型AIV疫苗候选株CK53/PR8,疫苗株的8个基因来源与预期完全一致。对rCK/53以及疫苗候选株CK53/PR8在MDCK和A549两种细胞中进行生物学特性的比较,在A549中复制差异不显著,而在MDCK中48 h和72 h两者复制具有明显差异。rCK/53反向遗传操作系统的建立和疫苗候选株CK53/PR8的构建为进一步开展H7N9亚型AIV跨宿主传播机制、致病机理及进一步的免疫保护实验奠定了基础。
- 李媛媛郭晶李旭勇王金良范俊梁立滨邓国华施建忠陈化兰
- 关键词：禽流感病毒
- 表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白重组新城疫病毒的构建以及密码子优化的HA免疫增强作用被引量：3
- 2014年
- 为构建表达H5N1亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白重组新城疫病毒(NDV)及比较密码子优化的HA免疫增强作用,本研究利用NDV LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统,分别构建了表达野毒型H5N1亚型AIV HA蛋白和密码子优化的HA蛋白的重组NDV,并分别命名为rL-H5HA和rL-optiH5HA。对拯救的重组病毒进行RT-PCR、间接免疫荧光和western blot鉴定,结果表明,两种重组病毒均可以在BHK-21细胞中以及鸡胚成纤维细胞稳定地表达HA蛋白。此外,rL-optiH5HA在体外增殖能力及在体内刺激产生抗体均显著高于rL-H5HA。本研究表明,密码子优化的HA重组NDV具有明显的免疫增强作用。本研究为研制安全、有效的新型禽流感疫苗提供了实验依据。
- 陈曦于桂梅刘景利王金良姜永萍葛金英步志高
- 关键词：HA蛋白重组新城疫病毒密码子优化
