李新
- 作品数：5 被引量：8H指数：2
- 供职机构：四川农业大学食品学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金四川省科技支撑计划四川省教育厅自然科学科研项目更多>>
- 相关领域：轻工技术与工程生物学医药卫生农业科学更多>>
- Raw264.7细胞向破骨细胞分化诱导培养体系的改良被引量：2
- 2014年
- 目的:通过改良细胞培养方案建立体外诱导Raw264.7细胞分化形成成熟破骨细胞(OC)的高效培养体系。方法:向Raw264.7细胞培养液α-MEM中添加50μg·L-1 M-CSF、100μg·L-1 RANKL和1×10-8 mol·L-1 1α,25-(OH)2D3,于5%CO2、37℃孵箱中培养12d,每3d换液1次,每次换液前对细胞进行短暂消化。倒置显微镜下观察细胞形态变化,并利用HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、FITCphalloidin染色和免疫荧光染色鉴定OC是否成熟并具有吞噬功能。结果:通过改良培养方法,在诱导过程中培养孔内的大部分区域始终保持单层细胞的生长状态。镜下观察和HE染色,诱导第12天时OC胞体覆盖培养面积的70%;FITC-phalloidin染色,伴随着OC成熟,伪足内出现的束状伪足小体逐渐变为环形,最终融合带状肌动蛋白环环绕在胞质周围;免疫荧光染色,诱导12d后OC表达的降钙素受体(CTR)较前体细胞显著增加,TRAP染色显示OC胞浆内呈现大量红色颗粒。提示获得的OC成熟并具有吞噬功能。结论:本实验通过改良培养方法,联合应用细胞因子50μg·L-1 M-CSF、100μg·L-1 RANKL和1×10-8 mol·L-1 1α,25-(OH)2D3建立了体外诱导Raw264.7细胞分化形成成熟OC的高效培养体系。
- 李新张舒岩杨立彬李冉蒋然然陈治光李树蕾李树红
- 关键词：破骨细胞巨噬细胞集落刺激因子核因子ΚB受体活化因子配体维生素D3
- 建鲤组织蛋白酶L的原核表达、纯化鉴定及多克隆抗体的制备
- 2015年
- 对原核表达的重组建鲤组织蛋白酶L(Cathepsin L,CAT L)蛋白进行尿素洗涤和Ni-NTA亲和层析纯化,该目的蛋白经300 mmol/L咪唑洗脱为单一峰,SDS-PAGE结合TSK-GEL G2000SWxl凝胶过滤高效液相色谱分析表明重组CAT L获得了高度纯化,分子量约28 k D,纯度超过95%。Z-Phe-Arg-MCA底物测活法显示该重组CAT L表现为半胱氨酸蛋白酶活性,能与其内源抑制因子Cystatin以1︰1的摩尔比结合,具有生物学活性。以纯化的重组CAT L蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗血清,经ELISA法检测获得的CAT L抗血清效价高于1︰512000;Western blotting鉴定结果表明该抗体具有良好的特异性,能够识别原核表达的重组CAT L蛋白。免疫组织化学分析结果表明,该抗体还能识别建鲤小肠、肝胰脏、脾、背肌和心肌组织表达的内源性CAT L蛋白。因此可利用该抗体从蛋白水平检测CAT L在鱼类不同组织中的表达和分布情况。
- 李树红陈志光李冉李新李松陈秀华蒋然然李美良马璐阳
- 关键词：组织蛋白酶L原核表达纯化多克隆抗体免疫组化
- 建鲤组织蛋白酶L的克隆表达、纯化及活性特征鉴定被引量：1
- 2015年
- 首先采用TA克隆技术克隆建鲤组织蛋白酶L（Cathepsin L,CAT L）成熟肽基因片段并进行双酶切鉴定,进而构建表达载体CAT L-p ET-30a并转入宿主菌E.coli BL21,经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在37℃诱导2 h表达重组CAT L蛋白。而后经尿素梯度洗涤和镍离子亲和层析纯化目的蛋白,并利用SDS-PAGE检测诱导效果和纯化过程。最后以荧光合成肽底物（Z-Phe-Arg-MCA）测活法鉴定建鲤重组CAT L的热稳定性、p H稳定性,以及鱼糜生产和冻藏中常用添加剂对其活性稳定性的影响。双酶切鉴定结果表明成功克隆了目的基因片段,与鲤鱼CAT L基因序列相似性为99.11%。SDS-PAGE分析表明经诱导、尿素梯度洗涤及亲和层析后,成功获得高度纯化目的蛋白,分子量约28 ku。活性鉴定结果表明重组CAT L在20~50℃及p H3.0~6.5范围内稳定;氯化钠、焦磷酸钠对重组CAT L活性的抑制作用呈现剂量依赖关系,而各浓度蔗糖、山梨醇则对其活性无明显作用。本研究成功克隆、表达和纯化了建鲤CAT L,并阐明了热、p H及鱼糜生产和冻藏中常用添加剂对该酶稳定性的不同影响。
- 李冉陈治光蒋然然陈秀华李树红李新钟海霞但静
- 关键词：建鲤组织蛋白酶L克隆表达纯化
- 草鱼肝胰中CPIs初步分离鉴定及其活性测定被引量：2
- 2015年
- 首先比较了偶氮酪蛋白（Azocasein）法和荧光合成肽底物法，在监测草鱼肝胰半胱氨酸蛋白酶抑制剂CPIs（cysteineproteinaseinhibitors）活性时的适用性。进而通过凝胶过滤高效液相色谱法、反相酶谱和免疫印迹法，对草鱼肝胰中CPIs的分子量分布及可能的家族类型进行定性鉴定。结果表明在粗提液中加入丝氨酸蛋白酶不可逆抑制剂（40mmol／LPMSF或0.4mmol／LPefablocSC），或经90℃加热5min，仅荧光合成肽底物法可准确地监测到CPIs活性的变化。液相色谱结果显示，草鱼肝胰中存在分子量（98、26、12、5-1ku）不同的CPIs活性部分。但反相酶谱法仅能够判断其中大于20ku的CPIs。而免疫印迹法证明存在约12ku的Cystatin（家族II）类型CPIs，发现小于12ku的显色条带，可能是该蛋白降解形成的低分子量的活性片段。
- 蒋然然梁宇陈治光杨锦李新但静李冉钟海霞李美良李树红
- 关键词：活性测定分子量分布
- 建鲤重组Cystatin蛋白的原核表达、鉴定及多克隆抗体制备被引量：3
- 2014年
- 目的:对建鲤半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPIs)Cystatin进行原核表达和纯化鉴定,并以重组Cystatin为抗原制备多克隆抗体。方法:用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导转入pET-30a-Cystatin的E.coli BL21(DE3)表达重组蛋白,经过Ni 2+-NTA镍离子亲和层析纯化重组Cystatin,高效液相色谱鉴定重组Cystatin的纯度,Azocasein法测定其对木瓜蛋白酶的抑制作用。利用QuickAntibody-Mouse5W快速佐剂和纯化的重组Cystatin免疫Balb/C小鼠获得抗血清,采用夹心ELISA法鉴定抗血清的效价,Western blotting和免疫组织化学法鉴定抗血清的抗原识别特异性。结果:原核表达的目的蛋白相对分子质量约20 000;镍亲和层析纯化后重组Cystain在SDS-PAGE上显示单一条带,纯度>95%;Azocasein法检测,0.014μg重组Cystain抑制木瓜蛋白酶活性达50%以上;ELISA夹心法检测获得的Cystatin抗血清效价达到1∶512 000;Western blotting检测,转入pET-30a空质粒的全菌蛋白中未检测到Cystatin存在,而在转入pET-30a-Cystatin的全菌蛋白及纯化各步样品中均检测到Cystatin信号,且均为单一条带;免疫组织化学检测,建鲤各组织呈现不同强度的Cystatin阳性染色,抗血清中的多克隆抗体与原核和真核表达的Cystatin均特异性结合。结论:成功表达和纯化了建鲤Cystatin;获得含高效价多克隆抗体的Cystatin抗血清,具有高特异性和灵敏性。
- 李松杨立彬张舒岩金羽陈秀华李新刘玲李树蕾李树红
- 关键词：半胱氨酸蛋白酶抑制剂原核表达多克隆抗体
