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类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞的差异蛋白质谱分析被引量：6: 2008年; 目的应用双向凝胶电泳-质谱法分析正常人及类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者滑膜成纤维细胞蛋白质组表达差异，探讨差异蛋白在类风湿关节炎发病中的作用。方法采用固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）双向凝胶电泳（two—dimensional gel eleetrophoresis，2-DE）分离正常人及类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞总蛋白质，银染显色，PDQuest软件分析图像，比较两种细胞蛋白质组表达差异，对差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行鉴定，并用Western blot验证部分表达差异蛋白质。结果①采用窄范围的pH4～7IPG胶条进行2-DE分析，正常人及RA患者滑膜细胞蛋白胶图上分别平均显示852、837个点。有49个蛋白点在正常、RA滑膜细胞问有2倍以上的显著性量变。②分别在胶图上共选取40个表达水平存在明显差异的蛋白质点进行质谱鉴定，鉴定出23个在RA患者滑膜细胞中表达上调蛋白质。Western blot验证Enolase α、Annexin I、CathepsinD、SOD2、Peroxiredoxin2在RA滑膜细胞中表达显著升高。结论正常人及类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞表达蛋白质组存在差异。这些差异蛋白可能参与类风湿关节炎的发病。; 柏干苹周丽娜贺伟峰罗高兴陈烯伟陈光兴胡晓红石东文方勇飞吴军; 关键词：滑膜成纤维细胞蛋白质组双向电泳类风湿关节炎

Foxp3酵母双杂交诱饵表达载体的构建、鉴定和其毒性及自激活效应检测被引量：2: 2006年; 目的利用酵母双杂交系统,构建人Foxp3酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其进行鉴定。方法获得正常人外周血PBMC,抽提mRNA,通过巢式RTPCR在人外周血PBMC中获得Foxp3基因片断,纯化后连接至pMD18T载体,测序正确,EcoRⅠ、SalⅠ双酶切pMD18TFoxp3和酵母表达载体pGBKT7,回收产物并连接,重组质粒命名为pGBKT7Foxp3,测序正确,用醋酸锂法将重组质粒转化酶母菌AH109,在缺陷性培养基上观察pGBKT7Foxp3在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能。结果RTPCR扩增出的DNA片段约1203bp,大小正确,与pMD18T载体连接,测序正确。构建的诱饵载体pGBKT7Foxp3,测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确。pGBKT7Foxp3转化酵母感受态AH109,在SD/Trp板上生长良好,在SD/Trp/XαGal平板上长出白色菌落,在SD/His/Trp/XαGal、SD/Ade/Trp/XαGal平板上不能生长,说明AH109[pGBKT7Foxp3]转化成功,对酵母菌株AH109不具有毒性且不具自主激活报告基因的功能。结论成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7Foxp3,可作为酵母双杂合系统中的“诱饵”,为下一步利用酵母双杂交系统筛选Foxp3相互作用蛋白创造了条件。; 周丽娜吴军罗高兴贺伟峰陈希炜柏甘萍石东文王庆红袁顺宗张小容胡晓红; 关键词：克隆 FOXP3 酵母双杂交

人骨关节炎滑膜成纤维细胞差异蛋白质谱初步分析被引量：5: 2006年; 目的应用双向凝胶电泳-质谱法分析正常人及骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者滑膜成纤维细胞蛋白质组表达差异,探讨差异蛋白在骨关节炎发病中的作用。方法采用固相pH梯度(immob ilized pH grad ient,IPG)双向凝胶电泳(two-d imensional gel electrophoresis,2-DE)分离正常人及骨关节炎患者滑膜成纤维细胞总蛋白质,银染显色,PDQuest2-DE软件分析图像,比较2种细胞蛋白质组表达差异,对差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行鉴定。结果胶图差异分析显示36个表达水平存在明显差异的蛋白质,选取15个点进行质谱鉴定,鉴定出6个表达上调蛋白质。结论正常人及骨关节炎患者滑膜成纤维细胞表达蛋白质组存在差异。这些差异蛋白可能参与骨关节炎的发病。; 柏干苹周丽娜贺伟峰罗高兴陈烯伟易绍萱胡晓红石东文陈光兴方勇飞吴军; 关键词：骨关节炎滑膜成纤维细胞蛋白质组双向电泳

S100A4,A10在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的表达及意义被引量：9: 2008年; 目的:探讨正常人与类风湿关节炎(RA)患者滑膜成纤维细胞蛋白质组表达差异,分析差异蛋白在RA发病中的作用.方法:应用固相pH梯度(IPG)双向凝胶电泳(2-DE)分离正常人及RA患者滑膜成纤维细胞总蛋白质;应用双向电泳凝胶分析软件(PDQuest 7.3.1)对2-DE凝胶进行量化比较分析;应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定部分差异蛋白质,并用Western Blot、免疫细胞化学技术验证表达差异蛋白质.结果:正常人及RA患者滑膜成纤维细胞蛋白2-DE凝胶图谱上分别平均显示896和992个点.有64个蛋白质点表达存在2倍以上的差异.选取9个在RA滑膜成纤维细胞中表达上调的蛋白质点进行质谱鉴定,成功鉴定出钙结合蛋白S100A4和S100A10两个蛋白质.经Western Blot、免疫细胞化学技术验证这两个蛋白在RA滑膜成纤维细胞中表达上调,与上述结果一致,并且发现S100A4在RA滑膜成纤维细胞中的表达分布发生了变化.结论:结合蛋白S100A4和S100A10可能参与RA的发病.S100A4在细胞中的表达易位可能与RA滑膜成纤维细胞表型改变有关.; 柏干苹周丽娜贺伟峰罗高兴陈烯伟陈光兴胡晓红石东文方勇飞吴军; 关键词：滑膜成纤维细胞双向电泳类风湿关节炎 S100A4基因

腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞成骨特性研究被引量：2: 2007年; 目的通过腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞(human marrowmesenchymal stem cells,hM-SCs),观察被修饰细胞CTLA-4Ig蛋白表达情况,以及基因修饰对hMSCs诱导成骨特性的影响。方法采用荧光显微镜观察腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染hMSCs的绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测确定转染率,观察对比转染前后细胞形态和细胞周期,用免疫细胞化学方法检测转染hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达,转染hMSCs成骨诱导培养3周后进行成骨特异性标记检测。结果分离培养的hMSCs CD105表达阳性,CD34表达阴性。重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hM-SCs的转染率为81.14%,CTLA-4Ig基因转染hMSCs(CTLA-4Ig-hMSCs)的形态无明显变化,生长良好。免疫细胞化学结果显示,CTLA-4Ig-hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达阳性,诱导培养3周的CTLA-4Ig-hMSCs,碱性磷酸酶染色呈强阳性,免疫细胞化学检测骨钙素表达阳性,钙的四环素荧光标记法显示细胞间有钙的沉积。结论腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hMSCs能够分泌CTLA-4Ig蛋白,并保持了成骨分化潜能,可用于异基因hMSCs作为骨组织工程种子细胞的应用研究。; 石东文代飞陈希炜贺伟峰胡晓红罗高兴吴军; 关键词：HMSCS CTLA-4IG 基因转染诱导成骨

hTERT基因转染显著延长人骨髓间充质干细胞增殖能力的实验研究被引量：2: 2007年; 目的构建含有端粒酶逆转录酶(human telom erase reverse transcriptase,hTERT)基因的逆转录病毒,感染人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs),观察外源性hTERT基因在hMSCs中的表达及其对hMSCs端粒酶活性和细胞增殖能力的影响。方法构建pLXSN-hTERT质粒,BamHⅠ酶切和测序鉴定,转染PT67包装细胞,G418抗性筛选获得产病毒阳性细胞克隆。用产病毒细胞珠和hMSCs共培养的方法转染hMSCs,G418抗性筛选。以未转染hM-SCs作为对照,用TRAPEZE方法检测hTERT基因转染hMSCs的端粒酶活性,用流式细胞仪检测细胞周期,并观察转染hMSCs的生长情况。结果成功构建了hTERT基因重组pLXSN-hTERT质粒,建立了产病毒pLXSN-hTER-PT67细胞株。获得了hTERT-hMSCs细胞群,与未转染的hMSCs相比,hTERT-hMSCs细胞群端粒酶活性明显增强,hTERT蛋白阳性表达细胞百分率提高,细胞的生命周期显著延长,细胞传代至46代,形态无明显改变,生长良好。结论逆转录病毒载体介导的hTERT基因转染可增强hMSCs的端粒酶活性,提高hMSCs的增殖能力。; 石东文代飞池君陈希炜贺伟峰胡晓红罗高兴吴军; 关键词：HTERT 逆转录病毒端粒酶人骨髓间充质干细胞

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石东文

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