周恩民
- 作品数：8 被引量：24H指数：4
- 供职机构：黑龙江八一农垦大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：黑龙江省农垦总局科技攻关项目博士科研启动基金黑龙江省教育厅科学技术研究项目更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 猪细小病毒NS1基因的原核表达被引量：2
- 2007年
- 根据GenBank发表的猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)中国株基因序列设计引物,通过PCR方法扩增到了PPV LJL12株NS1全长基因,将其克隆到原核表达载pET30a(+)上,成功构建原核表达载体pET30a-NS1,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。SDS-PAGE电泳显示NS1在大肠杆菌中得到成功表达,重组蛋白大小约为86ku,与预期大小相符;Western blot分析表明,该蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有良好生物学活性。NS1在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性,可作为鉴别诊断抗原用于PPV的临床检测。
- 冉旭华闻晓波孟凡周恩民
- 关键词：猪细小病毒NS1蛋白原核表达
- 猪细小病毒NS1蛋白主要抗原表位区的原核表达被引量：4
- 2008年
- 目的:用大肠杆菌表达猪细小病毒NS1基因的主要抗原表位区。方法:通过对GenBank发表的猪细小病毒(Porcine Par-vovirus,PPV)中国株非结构蛋白NS1的氨基酸序列分析,确定了其中抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,扩增出包含NS1主要抗原表位区的843bp的片段。酶切后连接到原核表达载体pET30a(+)上,构建的原核表达载体pET30a-NS1s转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达。结果:重组蛋白大小约为43kD,与预期大小相符。Westernblot分析表明,该蛋白能与标准阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有生物学活性。结论:NS1蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性。可作为鉴别诊断抗原用于PPV的临床检测。
- 冉旭华孟凡闻晓波单玉波周恩民
- 关键词：猪细小病毒NS1蛋白
- 猪细小病毒NS1基因的克隆与序列分析被引量：2
- 2008年
- 目的：扩增猪细小病毒（Porcine Parvovims，PPV）LJL12株NS1基因的全长序列，并进行同源性分析。方法：参考GenBank上公布的PPV中国株NS1基因序列，设计一对特异性引物扩增LJL12株NS1基因，测定序列，使用分子生物学软件进行同源性分析。结果：LJL12株PPV NS1基因全长1989bp，编码662个氨基酸。与其他PPV中国株NS1的核苷酸同源性在98．6％-100％之间，氨基酸同源性在98．5％-100％之间。其中，与南京株的同源性最高。结论：PPV NS1蛋白具有高度保守性，适合用作诊断抗原。LJL12株PPV NS1基因的克隆，为进一步研究NS1的功能和作用奠定了基础。
- 冉旭华闻晓波孟凡周恩民
- 关键词：猪细小病毒NS1基因
- 猪细小病毒NS1蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立被引量：4
- 2009年
- 通过分子生物学软件对GenBank中发表的猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)中国株NS1蛋白的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域,针对此区域设计了1对特异性引物。通过PCR方法扩增出长度为843bp的基因片段,将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,构建了原核表达载体pET30a-NS1,实现了PPVNS1蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中的高效表达。重组蛋白相对分子质量约为43 000,与预期相符。Western-blot试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性。以纯化的该蛋白作为包被抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为2 mg/L,一抗的最佳稀释倍数为1∶100,阳性标准为:待检血清D450≥0.36,且待检血清D450/阴性血清D450>2,作为阴阳性临界值,初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。用该方法对临床血清样本进行检测,间接ELISA判定为阳性的60份血清,经Western-blot试验只有45份为阳性。随机抽取100份猪血清样品与商品化试剂盒检测结果对比,符合率为96%,表明所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疾病的鉴别诊断奠定了基础。
- 冉旭华闻晓波孟凡周恩民
- 关键词：猪细小病毒NS1蛋白间接ELISA
- 检测PRRSV抗体的间接阻断ELISA方法的建立被引量：6
- 2008年
- 用大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达PRRSV重组N蛋白作为包被抗原,建立检测猪群PRRSV抗体的间接阻断ELISA方法,并对临床上采集的256份猪血清样本进行检测,结果66份呈阳性,用IDEXXPRRSV抗体检测试剂盒检测,检出的阳性血清为63份,两者的符合率为98.8%。Western blot检测结果58份阳性,两者的符合率为96.9%。试验结果表明,本试验所建立的间接阻断ELISA方法具有良好敏感性和特异性,可用于PRRS流行病学调查和疾病的诊断。
- 冉旭华赵喜红闻晓波倪宏波李树东周恩民
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白流行病学调查
- 猪戊型肝炎病毒ORF2主要抗原表位区间接ELISA方法的初步建立被引量：4
- 2010年
- 应用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端和N端的主要抗原表位区,重组蛋白命名为ORF2-C和ORF2-N,初步建立间接ELISA诊断方法。用重组蛋白ORF2-C和ORF2-N作为诊断抗原,对反应条件进行优化,初步建立ELISA诊断方法。抗原最适包被浓度ORF2-C为8μg/mL、ORF2-N为12μg/mL;血清最适稀释度均为1∶50,ORF2-C作用时间为50min、ORF2-N作用时间为90min;酶标抗体最适稀释度为1∶5000;ORF2-C判定标准:D450nm值≥0.348为阳性,D450nm值<0.348为阴性;ORF2-N判定标准:D450nm值≥0.397为阳性,D450nm值<0.397为阴性。与戊型肝炎病毒诊断试剂盒检测结果相比,阳性符合率分别为93.3%、86.7%。利用重组蛋白建立的ELISA方法特异性、敏感性和重复性均较好,且ORF2-C的检测效率明显高于ORF2-N,该方法的初步建立为进一步完善猪戊型肝炎病毒诊断方法奠定基础。
- 闻晓波王密冉旭华周恩民李晓娟侯喜林朴范泽
- 关键词：猪戊型肝炎病毒ORF2ELISA
- 猪圆环病毒2型ORF3基因的原核表达被引量：4
- 2010年
- 用原核表达系统表达猪圆环病毒2型ORF3基因,分析ORF3蛋白的抗原性。根据GenBank上公布的猪圆环病毒2型(PCV-2)核苷酸序列进行分析,针对ORF3基因设计并合成1对特异性引物,PCR扩增该基因,并将此片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,命名为pET32a-ORF3,转化大肠杆菌Rosetta-blue(DE3)pLacⅠ感受态细胞,1.0mmol/L IPTG37℃诱导表达。结果表明,PCR扩增得到315bp的片段,重组蛋白大小约为29ku,与预期大小相符。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能与抗His-tag的单克隆抗体反应,不与PCV-2阳性血清发生反应。猪圆环病毒2型ORF3基因能在大肠杆菌中成功表达,但与阳性血清之间没有反应原性,为进一步研究PCV-2ORF3蛋白的功能及特性奠定基础。
- 冉旭华李树东闻晓波王密杨焕民倪宏波侯喜林朴范泽邵磊李晓娟李冬野周恩民
- 关键词：猪圆环病毒2型ORF3基因原核表达
- PRRSV核衣壳蛋白(N蛋白)的克隆及其原核表达
- 2008年
- 目的:采用基因工程手段表达PRRSV VR 2332菌株的核衣壳蛋白(N蛋白)。方法:利用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR 2332菌株的核衣壳蛋白(N蛋白)基因并将其克隆到原核表达载pET30a(+)上,得到重组质粒rpET30a-PRRSV/N,并将其转入受体菌E.coliBL21(DE3)pLysS感受态细胞中,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE电泳检测和Western blotting分析表达产物的特性。结果:SDS-PAGE电泳检测和Western blotting分析结果表明,表达的蛋白大小约为19kDa,符合预期结果,并能与抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体发生特异性反应,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性,可应用于临床PRRSV抗体的检测。结论:在大肠杆菌表达系统内成功表达了PRRSV核衣壳蛋白(N蛋白)。
- 赵喜红闻晓波冉旭华周恩民
- 关键词：核衣壳蛋白原核表达BLOTTING
