张庆慧
- 作品数：4 被引量：0H指数：0
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- Sedlin蛋白稳定表达细胞株的建立
- 2008年
- 目的建立稳定表达Sedlin蛋白的细胞株,研究Sed-lin蛋白在细胞内的分布。方法扩增SEDL基因全长编码序列,经双酶切后克隆至真核表达载体pCDGFP中,将重组表达质粒转染至HEK293细胞,用G418筛选阳性克隆,荧光显微镜和Western blot检测Sedlin蛋白的表达,并观察Sedlin蛋白在HEK293细胞中的分布。结果经测序鉴定,成功构建了SEDL基因的真核表达载体,转染HEK293细胞后,Western blot检测,证明SEDL基因能够稳定有效的表达,荧光观察显示,Sedlin蛋白在细胞核和细胞质中都有表达。结论成功建立了稳定表达Sedlin蛋白的细胞株,Sedlin蛋白广泛分布于整个细胞中。
- 朱恒锐汪云飞张庆慧武标邢昕刘晓颖范礼斌
- 关键词：基因表达转染蛋白质类细胞株
- Sedlin突变体S124A对其与PAM14相互作用的影响
- 2009年
- 目的构建Sedlin的点突变体,研究其与PAM14在酵母中的相互作用,寻找其相互作用的位点。方法用蛋白质在线序列分析软件CPHmodels预测Sedlin蛋白的磷酸化位点,可能的磷酸化位点主要有S2、S30、S119、S124、Y115,针对其中一个磷酸化位点(S124)设计定点突变引物;以pAS-Sedlin为模板,以两条含有突变位点的互补序列为引物进行PCR扩增,将得到的PCR产物用DpnⅠ酶切除去模板,消化产物转化大肠杆菌感受态DH5α,对得到的阳性克隆进行测序;将构建的定点突变质粒pAS-SedlinS与pACT2-PAM14共转化至酵母Y190中,并对生长至合适大小的克隆进行β-半乳糖苷酶活性分析。结果构建了pAS-Sedlin的定点突变质粒pAS-SedlinS,其与pACT2-PAM14共转克隆的β-半乳糖苷酶活性反应呈阳性,并且Sedlin S124A蛋白与PAM14蛋白的相互作用比野生型Sedlin蛋白与PAM14蛋白相互作用强。结论成功构建了Sedlin S124A,Sedlin蛋白的S124并不是其与PAM14在酵母中相互作用的特异性结合位点。
- 汪云飞朱恒锐张庆慧邢昕武标刘晓颖范礼斌
- 关键词：双杂交系统技术骨骺
- 酵母双杂交技术筛选细胞极化蛋白PALS1的结合蛋白
- 2007年
- 目的筛选细胞极化蛋白PALS1的结合蛋白,进一步探讨PALS1的功能及其分子机制。方法将PALS1的全长cDNA序列克隆到载体pGBKT7中,重组的pGBKT7-PALS1质粒转入酵母AH109细胞,细胞置于SD/-Trp培养基上生长,阳性细胞再用Hela细胞的cDNA文库质粒转化,生长于SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal,显蓝色的克隆为阳性。阳性克隆细胞中的DNA被抽提后转化细菌细胞,然后抽提DNA进行酶切分型。合适的类型测序后进行BLAST检索分析。结果筛选到了13个阳性克隆,其中有2个是已知蛋白的基因即ATRAP和GLT28D1。结论利用酵母双杂交系统成功克隆了PALS1的结合蛋白的基因,为进一步研究PALS1蛋白的功能提供了有益的启示。
- 高雪敏刘晓颖张庆慧戴寒晶范礼斌
- 关键词：酵母菌双杂交系统技术结合蛋白
- PAM14的细胞转染表达和定位
- 2007年
- 目的构建带GFP标签的PAM14表达载体,将其转染至HEK293T细胞检测其表达,转染至COS7细胞观察PAM14蛋白在细胞内的定位。方法以含人PAM14全长cDNA序列的质粒pACT2-PAM14为模板,用PCR方法扩增PAM14全长序列,然后插入带GFP标签的载体pCDGFP中构建表达载体pCDGFP-PAM14,将构建的质粒转染至HEK293T细胞,提取总蛋白,进行Western-blot检测;转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位。结果成功构建了表达载体pCDGFP-PAM14,此表达载体在HEK 293T细胞中能够有效表达,转染表明PAM14在COS7细胞主要在核内表达,胞质内也有少量表达。结论实验结果为进一步了解PAM14的功能提供了一定的基础。
- 张庆慧汪云飞朱恒锐刘晓颖范礼斌
- 关键词：基因表达转染印迹法蛋白质
