目的探讨SYBR Green I实时荧光定量多重PCR结合融解曲线分析方法快速检测常见超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药基因的可行性。方法选取经测序验证携带有tem、shv、ctx-m-1组、ctx-m-9组耐药基因的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌作为阳性菌株,建立细菌耐药基因SYBR Green I实时荧光定量多重PCR检测体系,这四种耐药基因的扩增产物片段长度和融解温度(Tm值)都不同,可通过结合融解曲线分析加以区别。用此体系检测110株大肠埃希菌和94株肺炎克雷伯菌,根据特异性Tm值的有无和差别判断是否携带有耐药基因及携带耐药基因型别,结果与耐药表型、琼脂糖电泳、测序结果对照。结果经SYBR Green I实时荧光定量多重PCR结合融解曲线分析,分别有47株(42.7%)大肠埃希菌和34株(36.2%)肺炎克雷伯菌携带有这四种常见的ESBLs耐药基因,与表型确证实验和电泳结果比较达到100%的一致性;根据Tm值的不同,对耐药基因进行鉴别,携带单个耐药基因菌株的检测与电泳结果和测序结果比较达到100%的一致性;对携带多个耐药基因菌株的检测不能达到较好的分辨性。结论SYBR Green I实时荧光定量多重PCR结合融解曲线分析方法可以快速筛查常见超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药基因,对携带单个耐药基因的细菌的基因型能进行准确鉴定。这对指导临床医生合理使用抗生素进行临床治疗和对耐药细菌的流行病学监测具有重要价值。
目的评价常用细菌DNA提取试剂盒的性价比，筛选一种灵敏度较高、操作简单、价格合理的试剂。方法选取经测序确认的携带耐药基因的四种临床常见致病菌，经麦氏比浊仪比浊配制成一系列浓度的生理盐水菌悬液，分别用四种市售DNA提取试剂盒提取不同浓度菌悬液的DNA，经PCR扩增后电泳检测是否有耐药基因，比较四种试剂盒的优劣。结果国产DNA fast 200kit提取DNA的灵敏度可达到10^7-10^6 CFU的菌量，TIANamp Bacteria DNA Kit的灵敏度可达到10^7-10^6 CFU，AxyPrep^TMBacterial Genomic DNA Miniprep Kit的灵敏度可达到10^8CFU，QIAamp DNA Mini Kit的灵敏度可达到10^6-10^5CFU。结论比较四种试刺盒，QIAamp DNA Mini Kit试刺盒提取细菌DNA的灵敏度较高，适于细菌感染浓度较低标本的DNA提取，DNA fast200试剂盒操作最简便实用，并且价格便宜。
