熊敏
- 作品数：3 被引量：18H指数：2
- 供职机构：华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 一种碱裂解菌液直接电泳快速筛选重组子的方法被引量：4
- 2005年
- 目的 :从碱裂解法提取质粒DNA的原理 ,经过实验摸索获得一种快速、经济、结果可靠的菌液直接碱裂解电泳筛选重组子的方法。方法 :不需提取质粒DNA ,只需将细菌培养液碱裂解后直接进行普通琼脂糖凝胶电泳分析 ,就可以快速筛选出转化重组子。结果 :结果和提取质粒酶切鉴定鉴定结果一致。结论 :经实验证明菌液直接碱裂解电泳筛选重组子是一种快速、经济、可靠的方法。
- 熊敏李青李文涵费世江吴雄文
- 关键词：重组子
- 人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP融合蛋白表达载体的构建及其表达被引量：2
- 2006年
- 目的构建并表达了人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP(scHLA-A2)融合蛋白表达载体,为进一步制备HLA-A2四聚体及其功能研究奠定了基础。方法应用重叠延伸PCR(overlap-PCR)对编码HLA-A2的cDNA序列进行一个碱基的同义突变,并将β2m和HLA-A2胞外段亚单位两段编码序列的cDNA通过一疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行前后拼接,并利用引物所带的BSP编码序列,构建单链β2m-HLA-A2-BSP融合基因,将测序正确的β2m-HLA-A2-BSP融合基因插入原核表达载体pET-22b中,转化BL21(DE3)细菌,SDS-PAGE检测其表达,融合蛋白于体外抗原肽存在条件下稀释复性后由Western blot鉴定其空间构象。结果经DNA序列分析表明:同义突变与预期结果一致,β2m和HLA-A2-BSPl、inker的连接顺序、方向及序列完全正确,表达载体转化BL21(DE3)细菌后可表达β2m-HLA-A2-BSP融合蛋白,SDS-PAGE显示该融合蛋白分子量为45 kD,与理论值一致,将融合蛋白与特异性抗原肽在体外进行稀释复性后经Western blot鉴定表明该复合物能与HLA-Ⅰ类分子特异性结合的单克隆抗体W6/32结合。结论人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP融合蛋白的构建及其表达获得成功,经体外复性可获得HLA-Ⅰ类分子天然构象。
- 熊敏杨敬宁李青吴雄文
- BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定被引量：12
- 2005年
- 目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirAsubstratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Westernblot鉴定表达产物的生物素化活性。结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61300的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白。ELISA和Westernblot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化。结论:成功地制备了具有生物学活性的Bi-rA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂。
- 李青吴雄文熊敏翁秀芳卢小玲梁智辉龚非力
- 关键词：生物素化
