傅晓斌
- 作品数：4 被引量：12H指数：2
- 供职机构：中国计量大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金浙江省自然科学基金国家茶叶产业技术体系建设项目更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1的功能模式分析及亚细胞定位被引量：2
- 2017年
- 【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)重组化学感受蛋白CSP1与不同化学信息素的结合功能、模式及其亚细胞定位,明确触角特异表达的CSP1蛋白功能。【方法】将克隆的中蜂CSP1构建至p ET-32a(+)载体并转入BL21(DE3)感受态细菌中,挑取单克隆菌落接种于LB培养基,培养过夜后按1%(V/V)进行转接,继续培养至OD600≈0.4左右时,加入IPTG至终浓度为1 mmol·L^(-1)后继续诱导5 h。将诱导好的CSP1大肠杆菌菌液离心弃上清,再加入细菌裂解液超声破碎,离心后上清用镍柱对CSP1重组蛋白进行亲和层析纯化,再经PBS透析液透析后,最终获得可溶的具有生物活性的CSP1重组蛋白。设定荧光分光光度计的激发波长为281 nm,测定竞争性荧光探针1-NPN与CSP1的相互作用,用Scatchard方程计算其解离常数,再计算获得CSP1与各种候选化学信息素的亲和力。以CSPMbra A6晶体结构(PDB代码:1n8v)为模板,通过同源建模和分子对接解析CSP1蛋白与化学信息素的结合模式,根据Mol Dock Score选出最佳对接模型进行作用机理分析,获得结合时配基周围的CSP1残基分布以及氢键产生情况,以此获得信息素与CSP1的结合模式。最后将CSP1免疫注射兔子获得多克隆抗体,并对中蜂工蜂触角进行低温固定、脱水和包埋后进行超薄切片,然后对样品切片进行免疫胶体金电镜定位,以解析CSP1在触角感器中的亚细胞分布。【结果】成功诱导获得可溶性的重组中蜂CSP1蛋白,利用荧光光谱分析1-NPN与CSP1的解离常数K1-NPN为2.1μmol·L^(-1),结合位点数n为0.99,表明结合时基本以1:1结合,线性相关系数为0.9933。在9种化学信息物质中,CSP1与两种蜜蜂蜂王信息素成分对羟基苯甲酸甲酯(HOB)和9-羰基-2癸烯酸(9-ODA),和植物挥发物成分3-蒈烯均具有较强的结合能力,其中与CSP1亲和力最强的对羟基苯甲酸甲酯的[IC50]和解离常数KD分别达到10.1和7.68μmol·L^(-1)。分子�
- 谭静宋欣密傅晓斌唐明珠吴帆华启云李红亮
- 关键词：中华蜜蜂化学感受蛋白分子对接免疫细胞化学定位
- 茶尺蠖信息素结合蛋白PBP2的基因克隆、原核表达及其结合功能被引量：9
- 2017年
- 【目的】茶尺蠖(Ectropis obliqua)是中国茶区主要的鳞翅目害虫,其幼虫暴食性常给茶园带来巨大损失。鳞翅目昆虫雌雄个体间普遍存在着性信息素通讯环节,而茶尺蠖性信息素识别途径一直鲜有报道。论文旨在通过对茶尺蠖性信息素识别过程中的结合蛋白基因进行鉴定和功能研究,为茶尺蠖性信息素化学通讯和嗅觉信息识别传递机制提供理论依据。【方法】利用RT-PCR技术对从雄虫触角转录组数据中首次鉴定和发现的一个茶尺蠖信息素结合蛋白基因(pheromone-binding protein,PBP)2(EoblPBP2)进行全长cDNA序列克隆(Gen Bank登录号为KX421383)后,将该基因与pET32a载体连接构建表达载体。随后向导入pET32a/EoblPBP2表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中对其表达载体加入终浓度1 mmol·L^(-1)的IPTG进行蛋白的诱导表达,进一步利用镍NTA琼脂糖凝胶柱和含有咪唑的上清缓冲液分离目的蛋白,以PBS缓冲液作为透析液纯化得到高浓度重组蛋白。最后通过荧光竞争法,利用N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作为荧光报告子以放大荧光信号,随后向重组蛋白与1-NPN混合体系中分别加入(Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯以及10种测试气味后经过分子荧光光度计扫描得到相对荧光值,计算各配基的解离常数KD,研究重组蛋白与茶尺蠖性信息素和茶树挥发物的生理功能。【结果】EoblPBP2全长为492 bp,编码了163个氨基酸,蛋白相对分子质量为15.9kD,等电点为4.983,具有保守的6个半胱氨酸,根据分子进化树分析其应归属于昆虫PBPs家族。结合功能结果显示,10种测试气味均能将1-NPN与茶尺蠖EoblPBP2重组蛋白的混合体系于420 nm处的相对荧光值降至50%以下。其中β-紫罗兰酮、邻苯二甲酸二丁酯、苯乙醛、癸醛和反-2-癸烯醛等5种茶树挥发物质与EoblPBP2重组蛋白的结合能力较强,解离常数KD分别为7.923、14.830、30.368、28.068和27.597μmol·L^(-1)。
- 冯一璐傅晓斌吴帆崔宏春李红亮
- 关键词：茶尺蠖信息素结合蛋白原核表达
- 茶尺蠖信息素结合蛋白PBP2和气味结合蛋白OBP9、11功能及其物理化学机制研究
- 在昆虫的繁衍进程中，鳞翅目两性昆虫间往往通过性信息素的精巧识别来实现其交配行为的调控—即新羽化的处女雌虫释放在空气中的性信息素分子，可被远距离的同种雄虫敏锐而准确地感受到。雄虫对这种性信息素的识别与其触角感受器淋巴液中大...
- 傅晓斌
- 关键词：茶尺蠖信息素结合蛋白气味结合蛋白分子生物学
- 文献传递
- 一种基于信息素结合蛋白的茶尺蠖性信息素的筛选和鉴定方法
- 一种基于茶尺蠖信息素结合蛋白的性信息素筛选和鉴定方法，属于生物工程技术领域。其包括：收集茶尺蠖雄蛾触角总RNA；通过RT‑PCR获得茶尺蠖信息素结合蛋白的全长；构建茶尺蠖信息素结合蛋白的原核表达载体；通过IPTG诱导茶尺...
- 李红亮冯一璐赵磊吴帆傅晓斌
- 文献传递
