周卫辉
- 作品数：5 被引量：9H指数：2
- 供职机构：重庆医科大学附属儿童医院更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 胰岛素对阿尔茨海默病细胞模型淀粉样前体蛋白代谢的影响被引量：4
- 2020年
- 目的探索胰岛素通过影响淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)代谢对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)细胞模型的作用。方法采用不同浓度的胰岛素处理人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y和非神经源性细胞株HEK293、2EB2,CCK-8法检测胰岛素对细胞活性的影响;Western blot检测2EB2细胞和SH-SY5Y细胞经不同浓度胰岛素处理后APP、CTF、BACE1、ADAM10和PS1的表达,ELISA法检测Aβ40和Aβ42的水平;蛋白芯片筛选胰岛素介导的关键信号通路分子,Western blot检测上述细胞中胰岛素对信号通路AKT以及GSK3β蛋白磷酸化水平的影响。结果CCK-8检测结果显示,0~10μmol/L胰岛素浓度未对实验细胞的活性产生影响(P>0.05)。Western blot结果显示,与未处理组相比,1.00、10.00μmol/L胰岛素处理增加了APP、CTF的表达(P<0.05);在APP代谢关键酶中,BACE1表达显著增加(P<0.05)。ELISA结果显示1.00、10.00μmol/L胰岛素干预后,Aβ42的水平显著增加(P<0.05)。同时,蛋白芯片发现GSK3β为胰岛素作用的潜在靶点。Western blot结果显示,磷酸化AKT和磷酸化GSK3β蛋白的表达均下调,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论胰岛素对阿尔茨海默病致病性产物的产生有增强作用。
- 胡容王丹楼丹丹李廷玉周卫辉宋伟宏
- 关键词：阿尔茨海默病胰岛素淀粉样前体蛋白Β淀粉样蛋白
- 48孔板荧光素酶报告基因实验边缘效应被引量：3
- 2018年
- 为了研究48孔板荧光素酶报告基因实验边缘效应以及寻找可能消除边缘效应的方法措施。本研究用常规方法培养人胚肾细胞HEK293,运用脂质体转染试剂Lipofectamin 2000将荧光素酶报告基因质粒p GL4.13Z和内参质粒p RL-TK共转染入48孔板中的HEK 293细胞。转染后24 h用荧光素酶报告基因实验检测试剂测量细胞的荧光素酶活性,比较角落孔、边缘孔以及中间孔测定值的差异,以及内参照海肾荧光素酶活性校准后的差值,并通过细胞计数来观察此种差异是否与细胞数目和转染效率相关。在此基础上,寻找可能减小边缘效应的方法,如细胞种植入48孔板后将其室温静置、48孔板重叠、放弃使用边缘孔。运用48孔细胞培养板进行荧光素酶报告基因实验存在边缘效应,边缘孔与中间孔的荧光素酶活性测定值有显著的差异且有统计学意义（p〈0.05）,而边缘效应的产生与细胞数目和转染效率无明显关联。细胞种植入48孔板后将其室温静置1.5 h、或重叠一个48孔板以及空置边缘孔都不能减弱边缘效应;然而将48孔板四周边缘孔填充液体（磷酸盐缓冲液（1＊PBS）,水）,可以削弱边缘效应。用48孔细胞培养板进行荧光素酶报告基因实验会产生边缘效应,并可能造成对实验结果的误判;48孔板四周边缘孔填充相应的液体可以削弱边缘效应。
- 廖丹徐云飞孟莎莎周卫辉
- 儿童孤独症相关基因NRXN1β启动子功能分析
- 2015年
- Neurexins是神经特异性突触蛋白,Neurexin1β结构的异常与孤独症密切相关。为分析孤独症相关基因NRXN1β最小启动子和调节基因转录的功能元件,本文构建了含NRXN1β基因上游调控区不同区域的荧光素酶报告基因质粒,转染HEK293细胞后,利用检测双荧光素酶报告基因的转录活性以确定NRXN1β基因最小启动子区,进而筛选出相应的显著增强或抑制报告基因活性的功能区;同时,为鉴定顺式作用元件,利用基因定点突变技术对基因功能区内和临近DNA序列进行连续的碱基突变;最后,采用转录因子预测工具对启动子功能区内的转录调控元件进行分析。结果首次发现NRXN1β最小启动子区位于?88^+156 bp,?88~?73 bp和+156^+149 bp可增强启动子活性,+229^+419 bp可抑制启动子活性,且?84~?63 bp为能够显著性增强启动子活性的顺式作用元件,该区域可能存在DBP(Albumin D-site-binding protein,DBP)和ABF1(Autonomously replicating sequence-binding factor 1,ABF1)两个转录因子结合位点。
- 刘静茹孟莎莎周卫辉
- 关键词：启动子DBP转录因子
- 突触黏附分子编码基因NRXN2α启动子的功能分析被引量：1
- 2020年
- Neurexins是突触前膜细胞黏附分子,参与神经元和脑回路的跨突触信号传递,其基因表达水平的调控密切影响着突触可塑性和特异性。为分析NRXN2α基因转录水平的调控,该研究构建了含有NRXN2α基因5′端不同区域的荧光素酶报告基因质粒,转染HEK293和U-87 MG细胞并检测双荧光素酶报告基因的表达水平,该研究确定了具有较强转录活性的NRXN2α基因启动子区域–911/+60(转录起始位点为+1),并鉴定了具有基础转录活性的最小启动子区域–58/+60,以及4个正向调控功能区域–911/–629、–109/–76、–49/–17、–17/+60,和1个负向调控功能区域+146/+238。最小启动子区域序列分析鉴定了1个典型的核心启动子元件initiator(Inr)。总之,该研究首次克隆了NRXN2α基因的启动子区域并进行了功能分析,为进一步阐明转录调控机制和加深对突触可塑性的理解奠定了基础。
- 周家红郭印孟莎莎周卫辉
- 关键词：启动子转录突触
- 离心法增加HaCaT细胞的基因转染效率被引量：1
- 2018年
- HaCaT细胞是自发性的人永生化表皮细胞株,常用于皮肤功能与疾病的相关研究,但常规脂质体法转染该细胞的效率极低。该研究主要探讨离心是否能够增加脂质体法转染HaCaT细胞的效率。以Lipofectamine~?2000为脂质体转染试剂,pEGFP-C1为质粒转染HaCaT细胞后分别使用常规法和离心法处理,利用荧光倒置显微镜和流式细胞仪测定转染效率;细胞增殖活力实验检测离心是否对细胞活力产生影响;荧光素酶报告基因、Western blot实验检测离心法实际效应对目的基因表达的影响。结果表明,离心法处理组所测得的转染效率均高于常规法处理组,差异有统计学意义。荧光素酶报告基因实验、Western blot实验则进一步证实了转染后离心的性价效应能增加目的基因的表达,具有较高的实用性。综上所述,常规转染步骤后离心能够增加HaCaT细胞的基因转染效率。
- 徐云飞孟莎莎周卫辉李红梅
- 关键词：离心转染效率HACAT细胞
