付海鹏
- 作品数：1 被引量：2H指数：1
- 供职机构：东北农业大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 精子介导的转基因效率关键影响因素被引量：2
- 2014年
- 【目的】精子介导的转基因技术简单易行,其作为制备转基因动物的一种方法已经被很多科学家所认同。但是不同实验室的研究结果显示其稳定性和重复性较低,转基因效率差异极大。现将主要探讨导致这种现象的原因。【方法】小鼠精子获能后分别与0、15、30和300nmol·L-1的Cy-3标记DNA(Cy-3-DNA)在37℃共孵育30 min。其后,血细胞计数板检测小鼠精子的活率;共孵育精子进行直接涂片,DPBS洗涤后涂片,DnaseI消化后涂片,精子涂片置于荧光显微镜下,记录视野中的精子总数及显示Cy-3信号的精子数,用于统计精子结合及内化DNA的效率。精子与300 nmol·L-1的Cy-3-DNA共孵育后,以50μmol·L-1的P4诱导精子顶体反应,统计顶体反应前后显示Cy-3信号的精子比例。精子分别与15和300 nmol·L-1 Cy-3-DNA共孵育后,精子进行体外受精,在荧光镜下观察合子期受精卵中Cy-3-DNA的存在位置。按照优化后的条件,精子分别与0、15和300 nmol·L-1 pEGFP-C1质粒共孵育后进行体外受精,制备转基因胚胎。比较试验组和对照组的受精率和发育效率,采用PCR和RT-PCR方法检测囊胚期外源基因整合和表达情况。【结果】获能后的精子分别与0、3、15、30和300 nmol·L-1的Cy-3-DNA共孵育后,精子的活率分别为82.21%、73.63%、77.38%、76.33%和77.80%;洗涤前精子结合DNA的效率分别为76%、94%、99%和100%,15、30和300 nmol·L-1组精子结合率均显著高于3 nmol·L-1组(P<0.05)。洗涤后精子结合DNA的效率,分别为45%、66%、84%和87%,消化后精子内化DNA的效率分别为44%、56%、71%和76%,并且洗涤后精子结合及消化后精子内化DNA的效率都为300 nmol·L-1组和30 nmol·L-1组均显著高于其他两组,而15 nmol·L-1组显著高于3 nmol·L-1组(P<0.05);Image J对精子结合Cy-3-DNA的强度进行分析的结果表明,外源DNA的量随着外源DNA浓度的增加而显著增加(P<0.01)。顶体反应后,精子顶体部DNA会有丢失,�
- 焦明霞牟彦双格日乐其木格张琳琳孔庆然付海鹏刘忠华
- 关键词：顶体反应小鼠
