杨燕
- 作品数：5 被引量：18H指数：3
- 供职机构：湖南师范大学生命科学学院更多>>
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- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona的核糖体工程改造对丁烯基多杀菌素合成的影响被引量：8
- 2016年
- 核糖体工程是以微生物的各类抗生素抗性突变为筛选标记,高效获得次生代谢产物合成能力提高的突变株的一种育种新方法。通过核糖体工程技术,使用链霉素对须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona进行抗性选育,以获得高产丁烯基多杀菌素突变菌株。对原始菌株和所获得的突变菌株代谢产物的研究发现,相对于原始菌株,其中突变株S13的丁烯基多杀菌素产量提高幅度最大,相比原始菌株提高了1.79倍。经质谱测定表明,其代谢物中比原始菌株多了一种丁烯基多杀菌素组分Spinosynα1。对抗性突变株S13的DNA序列进行分析,发现在编码核糖体S12蛋白的rps L基因保守区域中出现点突变,第314位和第320位的胞嘧啶(C)分别突变为腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T),对应的氨基酸残基分别由脯氨酸突变为谷氨酰胺,丙氨酸突变为缬氨酸。研究显示,突变株S13遗传稳定性良好。
- 罗林根杨燕魏慧穰杰唐琼胡胜标孙运军余子全丁学知夏立秋
- 关键词：放线菌链霉素次级代谢
- 丁烯基多杀菌素高产菌株的巴龙霉素抗性筛选被引量：10
- 2015年
- 为了提高须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona的丁烯基多杀菌素产量水平,利用核糖体工程技术,对其进行巴龙霉素抗性筛选,在10×MIC巴龙霉素浓度下,分离得到巴龙霉素自发抗性突变株54株。通过对原始菌株和突变株代谢产物变化的初步研究发现,相比于原始菌株,丁烯基多杀菌素组分在抗性突变株中的合成能力有明显差异,有6株抗性突变株的产量明显高于原始菌株,约20%左右的突变株产量提高,约45%左右的突变株产量降低。其中突变株P-7的丁烯基多杀菌素产量提高幅度最大,相比原始菌株提高2.2倍。对巴龙霉素抗性突变株P-7进行DNA序列分析,在编码核糖体S12蛋白的rps L基因保守区域中发现点突变,第314位的C突变为A,由脯氨酸突变为谷氨酰胺;第320位的C突变为T,由丙氨酸突变为缬氨酸。
- 邬洋徐妙罗林根杨燕夏立秋
- 关键词：巴龙霉素RPSL基因
- 环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响被引量：5
- 2014年
- 【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白(cyclic AMP receptor protein,Crp)基因在刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)中的过量表达,研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响,促进多杀菌素的生物合成。【方法】PCR扩增环腺苷酸受体蛋白基因(crp),通过限制性酶切、连接方法构建中间载体pOJ260-cm-PermE-crp,使crp置于红霉素增强型启动子PermE的控制下;PCR扩增PermE-crp基因片段,利用Red/ET同源重组技术将PermE-crp亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建成Crp表达载体pUC-spn-PermE-crp。然后,采用接合转移方法将重组载体pUC-spn-PermE-crp导入野生型刺糖多孢菌中,通过单交换同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上,以染色体上整合了原始质粒pUC-spn的刺糖多孢菌作为对照菌株。利用PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因及目的基因的方法鉴定阳性接合子;观察工程菌株及对照菌株在不同固体培养基中的生长及菌落形态差异,同时比较工程菌株及对照菌株在液体培养基中的生长情况,测定生长曲线。借用扫描电子显微镜观察工程菌株及对照菌株的菌丝体形态;采用高效液相色谱检测工程菌株及对照菌株中多杀菌素生物合成情况。【结果】采用分子生物学方法成功构建了Crp重组表达载体pUC-spn-PermE-crp,并通过接合转移导入到刺糖多孢菌中;PCR检测结果显示,工程菌株作为模板扩增出长约2 kb的cm-PermE-crp目的条带,说明crp已成功整合到刺糖多孢菌染色体上,并且获得的重组工程菌株S.spinosa-Crp遗传性能稳定。在BHI培养基和ISP-2培养基上,工程菌株S.spinosa-Crp孢子萌发及形成速率与对照菌株S.spinosa-1相比均有所延迟,但在R6培养基上两者生长速率及菌落形态无明显差异。与对照菌株S.spinosa-1相比,液体培养基中工程菌株S.spinosa-Crp二次生长现象消失,且生物量略高于S.spinosa-1。扫描电�
- 徐妙邬洋杨燕夏立秋
- 关键词：刺糖多孢菌多杀菌素RED
- 亮氨酰氨肽酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及次级代谢产物合成的影响被引量：3
- 2016年
- 【目的】构建亮氨酰氨肽酶基因(pep A)被阻断的刺糖多孢菌工程菌株,并鉴定该基因对刺糖多孢菌菌丝形态、生物量、菌体全蛋白表达水平及产多杀菌素能力的影响,探究该基因调控多杀菌素合成的可能机制。【方法】利用PCR扩增刺糖多孢菌中的pep A基因同源片段,经酶切连接技术构建敲除载体p OJ260-pep A;通过接合转移和单交换同源重组将该载体整合至刺糖多孢菌染色体中,获得工程菌株S.sp-△pep A;利用培养特征、形态学、高效液相色谱、SDS-PAGE等方法对菌株进行研究分析。【结果】工程菌株S.sp-△pep A菌丝片段化程度加剧,生长态势被延缓且生物量降低,但有效促进了多杀菌素的生物合成。阻断亮氨酰胺肽酶基因的表达使刺糖多孢菌菌体全蛋白表达情况发生明显改变,找到表达水平显著上调的差异蛋白核糖体蛋白亚基和醛基脱氢酶,核糖体蛋白亚基通过影响蛋白质代谢对菌体生长产生影响;醛基脱氢酶则可与乙醇脱氢酶、乙酰辅酶A的合成酶相互作用影响辅酶A合成,而辅酶A是合成多杀菌素的重要底物。【结论】在刺糖多孢菌合成多杀菌素的次级代谢过程中,pep A基因作为负调控因子发挥作用。
- 杨燕罗林根徐妙夏立秋
- 关键词：刺糖多孢菌阻断多杀菌素
- 聚磷酸激酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及多杀菌素合成的影响被引量：2
- 2014年
- 聚磷酸激酶基因(Polyphosphate kinase gene,ppk)是放线霉菌中的一种影响抗生素合成的全局性负调控因子,阻断该基因能显著提高其次级代谢产物产量。本文利用PCR扩增了刺糖多孢菌中的ppk基因中间片段,经酶切连接技术将其克隆到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pOJ260上,构建阻断型载体pOJ260-ppk;通过接合转移将该功能质粒导入刺糖多孢菌中,获得了遗传性能稳定的重组菌株S.sp-△ppk。对工程菌株的PCR检测结果显示,ppk基因片段已整合到刺糖多孢菌染色体上并成功阻断了该基因的表达。摇瓶发酵结果显示,工程菌株多杀菌素产量较原始菌株提高了122%。阻断聚磷酸激酶基因的表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长发育产生了影响,并有效地促进该菌多杀菌素的生物合成。
- 杨燕罗林根唐斯佳徐妙丁学知胡胜标孙运军夏立秋
- 关键词：刺糖多孢菌阻断多杀菌素
