- 肠道病毒71型不同病毒株3D蛋白对细胞损伤的作用
- 2017年
- 目的 比较肠道病毒71型（EV71）SDLY11株和SDLY107株3D蛋白对细胞的损伤程度.方法 EV71病毒株SDLY11和SDLY107分别取自轻症手足口病患儿和重症手足口病患儿.反转录PCR扩增目的基因11-3D-Flag和107-3D-Flag,分别将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,连接产物转化至大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切和测序鉴定.重组质粒转染人横纹肌肉瘤（RD）细胞,间接免疫荧光试验和蛋白质印迹检测3D蛋白表达,乳酸脱氢酶（LDH）检测3D蛋白导致的细胞损伤,噻唑蓝（MTT）比色法测定3D蛋白对细胞增殖的影响,Annexin-V/Pl双染法测定3D蛋白引起的细胞凋亡.各组间两两比较方差齐采用LSD-t检验,方差不齐采用Dunnett T3检验.结果 反转录PCR扩增获得1 400 bp片段,酶切鉴定重组质粒后分别获得1 400 bp和5 400 bp片段,测定序列与目的基因一致.间接免疫荧光试验观察到特异性荧光,蛋白质印迹显示目的蛋白相对分子质量为55×10^3.LDH结果显示SDLY11株3D蛋白转染组的吸光度（A）490值高于SDLY107株3D蛋白转染组,分别为0.790±0.048和0.641±0.018,差异有统计学意义（t=5.14,P〈0.05）,SDLY11株3D蛋白引起的细胞膜损伤情况较SDLY107株3D蛋白严重.MTT比色法结果显示SDLY11株3D蛋白转染组的A570值低于SDLY107株3D蛋白转染组,分别为1.028±0.020和1.081±0.002,差异有统计学意义（t=3.31,P〈0.05）,SDLY11株3D蛋白对细胞增殖活性的影响大于SDLY107株3D蛋白.Annexin-V/PI双染法结果显示,SDLY11株3D蛋白转染组和SDLY107株3D蛋白转染组的细胞凋亡百分比分别为（1.471±0.246）%和（1.465±0.237）%,差异无统计学意义（t=0.04,P=0.973）.结论 与SDLY11株3D蛋白相比,SDLY107株3D蛋白引起的细胞损伤程度较轻微,且对细胞增殖活性的影响较弱,更有利于病毒在细胞内的复制.
- 白永娟庄志超郝树彬李纯王莉鸿袁晓晶赵丽王志玉温红玲
- 关键词：细胞损伤
- 人C组轮状病毒VP8~*蛋白组织血型抗原结合特征及其结构基础
- 轮状病毒(rotaviruses,RVs)是呼肠孤病毒科轮状病毒属的双链RNA病毒,是引起人类和动物急性胃肠炎的重要病原体,在全球范围内,每年可导致约20万5岁以下儿童死亡。RVs病毒颗粒具有三层蛋白衣壳,最外层的刺突状...
- 王莉鸿
- 关键词：受体结合晶体结构
- 文献传递
- 肠道病毒71型3CD嵌合病毒及其拯救方法和应用
- 一种肠道病毒71型3CD嵌合病毒及其拯救方法和应用，拉丁文学名：(Human？enterovirus71？3CD？chimeric？virus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校...
- 温红玲郝树彬乔乔李静马英伟庄志超王莉鸿王志玉
- 文献传递
- 肠道病毒71型3C嵌合病毒及其拯救方法和应用
- 一种肠道病毒71型3C嵌合病毒及其拯救方法和应用，拉丁文学名：(Human？enterovirus？713C？chimeric？virus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内，...
- 温红玲郝树彬李静乔乔马英伟庄志超王莉鸿王志玉
- 文献传递
- 肠道病毒71型3D重组病毒的拯救
- 2017年
- 目的利用反向遗传技术将肠道病毒71型(EV71)弱毒株SDLY1的3D蛋白置换入强毒株SDLY107,拯救重组病毒,为EV71 3D蛋白的研究提供操作平台。方法利用重叠PCR的方法得到3D编码区的重组片段,T-A克隆插入p MDl9-T载体。通过双酶切、T4连接将其置换到含有SDLY107株全长的质粒p MD19-T-107中。体外转录获得感染性RNA,转染Vero细胞,盲传3代得到重组病毒SDLY 107(1-3D),通过PCR和q RT-PCR对重组病毒进行鉴定。结果 PCR扩增得到大小为600、1 400和200 bp的3D区及其左右片段;重叠PCR扩增得到大小为2 100 bp的1-3D片段;双酶切鉴定重组质粒得到大小为7 400和2 700 bp的片段,测序结果证实3D区置换成功;感染性RNA转染Vero细胞后,接种至第3代时观察到细胞皱缩变圆,折光性增强;PCR鉴定重组病毒得到大小为226 bp的片段;q RT-PCR检测到细胞中病毒量于24 h开始缓慢增加,48 h后快速增多,至72 h后病毒量不再增长。结论成功拯救了重组病毒SDLY107(1-3D),为进一步研究3D蛋白的毒力和其在EV71致病机制中的作用提供基础。
- 白永娟庄志超郝树彬王莉鸿李纯鲁燕赵丽王志玉温红玲
- 关键词：肠道病毒71型重组病毒
