颜华
- 作品数：18 被引量：48H指数：4
- 供职机构：西北农林科技大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：中央高校基本科研业务费专项资金国家教育部博士点基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学轻工技术与工程化学工程更多>>
- 角蛋白酶基因gm2886在密旋链霉菌ACT12中的表达及鉴定被引量：6
- 2017年
- 通过生物信息学分析,在本实验室分离得到的1株羽毛高效降解菌微白黄链霉菌Fea-10基因组中发现基因gm2886(GenBank Accession Number:KY368946)可能编码一新的角蛋白酶,通过在该基因5'端和3'端分别连接红霉素抗性基因启动子(PermE)和组氨酸标签编码序列并构建在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pSET152上,接合转入密旋链霉菌Streptomyces pactum ACT12,从而实现了异源表达,蛋白纯化后对其酶学性质进行了研究。实验结果表明,带有组氨酸标签编码序列的gm2886在密旋链霉菌ACT12中可以表达分泌得到1个大小约为36 kDa的蛋白。多种底物检测表明异源表达得到的重组蛋白GM2886-His6具有蛋白酶活性,可以降解水不溶性的天青角蛋白和羽毛粉;其最适温度和pH分别为50℃和pH 10.0。PMSF可抑制GM2886-His6的酶活,而EDTA不能,说明该酶为丝氨酸蛋白酶。本研究为从分子水平上解析羽毛高效降解菌Fea-10的活性机理,从而进一步开发其应用潜力提供了基础,同时可为该类蛋白酶的研究提供借鉴。
- 马怡茗柯欣李晓霞舒伟学杨文翰刘亚勇颜霞贾良辉颜华
- 关键词：角蛋白酶异源表达重组酶
- 一株家禽羽毛角蛋白降解菌的分离与鉴定被引量：9
- 2015年
- 为了探寻降解家禽羽毛角蛋白的微生物资源,利用富集及驯化培养的方法,从家禽养殖场长期堆积废弃羽毛的土壤中,分离能够有效降解羽毛角蛋白的细菌,并对其降解效果进行初步研究,结果分离筛选出1株能以羽毛角蛋白为唯一碳氮源的菌株N01。经形态特征观察,生理生化特征鉴定和16SrDNA序列分析,初步鉴定其属于节杆菌属。系统发育树显示,该菌株与金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)的相似性最高,达99%,因而确定其为金黄色节杆菌。该菌株经过72h发酵,对羽毛角蛋白的降解率达75%,表明该菌株对羽毛角蛋白有明显的降解作用。该菌株的分离鉴定为微生物降解利用家禽羽毛角蛋白提供了新的种质资源。
- 周童娜杨文翰赵江婷赵婷婷安晓英颜华贾良辉
- 缬草内生菌和根际放线菌的分离及安莎类抗生素的筛选被引量：3
- 2019年
- 【目的】分离缬草内生菌及根际放线菌,筛选其中含安莎霉素类抗生素生物合成基因的菌株,挖掘其活性次级代谢产物资源。【方法】从缬草根、茎、叶及根际土壤中分离内生菌和根际放线菌,检测其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、核桃溃疡病菌、苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌的抑菌效果。设计2种简并引物,用PCR方法从抑菌效果较好的菌株中筛选含安莎霉素类抗生素基因(AHBA)的菌株。分析目标菌株的最佳发酵培养基和最适发酵时长,对发酵分离物进行HPLC和质谱分析,检测其可能的次级代谢产物。【结果】试验共分离到145株菌,其中内生菌27株,占总菌株数的18.6%,根际放线菌118株,占总菌株数的81.4%;33株对病原菌有较好的抑菌效果,占总菌株数的22.8%。筛选到1株含AHBA基因的菌株AJ21,初步鉴定其为链霉菌。菌株AJ21最佳发酵培养基为SPY培养基,最佳发酵时间为6d。菌株AJ21发酵液经分离纯化、HPLC检测和质谱分析,初步确定其含有的安莎霉素类抗生素为放线菌素D。【结论】药用植物缬草内部及根际蕴含丰富的放线菌资源,具有良好的生物学活性。
- 吴佳李晓霞舒伟学安晓英安雪莹颜华贾良辉
- 关键词：缬草内生菌
- 吉兰泰盐湖土壤嗜盐菌的分离及其产四氢嘧啶的研究被引量：1
- 2019年
- 【目的】对吉兰泰盐湖土壤嗜盐菌进行分离鉴定及生物学特征和系统发育分析,探索利用菌株合成四氢嘧啶的可能性。【方法】从内蒙古吉兰泰盐湖采集土壤样本,通过0,1%,2%,3%,4%,5%,6%,8%,10%,12%,14%,16%,18%,20%(质量分数)NaCl梯度耐盐试验,对分离放线菌进行分类统计。对分离得到的2株边界极端嗜盐菌JG5、JG9进行培养特征观察和生物学特性研究,基于16SrRNA基因序列构建系统发育树。利用四氢嘧啶基因簇中最为保守的ectB基因,合成简并引物,PCR扩增筛选含有四氢嘧啶基因簇的菌株。体积分数80%乙醇法抽提胞内四氢嘧啶,薄层层析(TLC)定性检测菌株胞内四氢嘧啶的存在情况,高效液相色谱(HPLC)法定量检测不同NaCl处理(质量分数为0,5%,10%,15%)JG5和JG9的胞内四氢嘧啶积累量。【结果】从吉兰泰盐湖土壤中分离得到嗜盐放线菌28株,其中主要为中度嗜盐放线菌,占总数的60.7%;弱嗜盐菌次之,占21.4%;非嗜盐菌3株,占10.7%;边界极端嗜盐菌最少,有2株,分别为JG5和JG9,占7.2%。PCR结果显示,28株中有17株含四氢嘧啶基因簇,占60.7%。生理生化特征研究结果显示,2株边界极端嗜盐菌JG5、JG9能利用的碳源种类丰富,也可利用多种氨基酸作为氮源,但JG9不能利用柠檬酸钠作为碳源,JG5和JG9均不能利用谷氨酸作为氮源;JG5和JG9都能使硝酸盐还原、明胶分解、牛奶凝固与胨化,都能产生H_2S,能降解纤维素,两者都不能分解尿素。系统发育树表明,2株极端嗜盐菌皆属于链霉菌属(Streptomyces)的密旋链霉菌(Streptomyces pactum),且亲缘关系较近。薄层层析结果表明,17株中有11株菌株可产四氢嘧啶。高效液相色谱分析结果显示,NaCl质量分数为10%时,JG5胞内四氢嘧啶积累量达最大值,为80.35mg/L;NaCl质量分数为5%时,JG9积累量达到最大值,为97.89mg/L。【结论】分离菌株大多含有四氢嘧啶基因簇,部分能够生产四氢嘧啶。2株边界极�
- 洪煜高波严冬安晓英颜华贾良辉
- 关键词：嗜盐菌生物学特征系统发育四氢嘧啶吉兰泰盐湖
- 羽毛降解杆状链霉菌S-28遗传转化系统的建立与优化被引量：4
- 2018年
- 【目的】建立羽毛降解杆状链霉菌(Streptomyces bacillaris)S-28的遗传转化系统,并对其进行优化,为该菌株的遗传改造奠定基础。【方法】以大肠杆菌-链霉菌穿梭整合型质粒pSET152为出发质粒,大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1/pSET152为供体,羽毛降解杆状链霉菌S-28孢子为受体进行接合转移试验,并对影响接合效率的培养基种类、MgCl_2浓度、热激温度、预萌发时间、供受体比例和接合转移时间等要素进行优化。【结果】确定筛选羽毛降解杆状链霉菌S-28菌株接合转化子的抗生素为安普霉素≥10μg/mL或卡那霉素≥20μg/mL;成功将pSET152转入到杆状链霉菌S-28中。优化的S-28菌株接合转移条件为:以MS为接合转移最适培养基,MgCl_2浓度为10mmol/L,孢子萌发条件为40℃热激10min且不进行预萌发处理,供受体比例为10∶1,接合转移时间18~20h,此条件下接合转化效率最高达到10-4。【结论】建立并优化了羽毛降解杆状链霉菌S-28的遗传转化系统,接合转化效率最高可达到10^(-4)。
- 张晋龙马怡茗舒伟学李晓霞柯欣颜华贾良辉
- 关键词：遗传转化系统
- 拟无枝酸菌属羽毛降解菌株BJA-103的诱变育种被引量：1
- 2021年
- 【目的】对具有羽毛降解能力的BJA-103菌株进行硫酸二乙酯(DES)诱变,筛选羽毛降解速率更快、降解程度更高的突变株,并对突变株产生的角蛋白酶性质进行初步探究,为其进一步扩大发酵及生产应用提供理论依据。【方法】使用DES对BJA-103菌株进行诱变,涂布解除氮代谢分解调节筛选培养基为第1次初筛,点植法接种牛奶平板为第2次初筛,羽毛摇瓶降解为复筛。得到理想突变株后,对该突变株进行羽毛降解试验,初步探究降解时间、温度、pH对角蛋白酶活性的影响。【结果】筛选获得解除氮代谢分解调节突变株库(1253株),牛奶平板筛选水解圈宽度为8.5~12 mm的突变株5株(RT、BM′、CV′、FX′、NK′),平均水解圈大小为野生型的2.5倍。羽毛降解复筛得到突变株NK′,降解试验中,其48 h内的羽毛降解率为65.29%,远大于野生型(12.82%);其最终降解率为90.74%(降解144 h),大于野生型的降解率79.24%。突变株NK′产生的角蛋白酶最适发酵时间为72 h,最适反应温度为70℃,最适反应pH为11。【结论】筛选出1株羽毛降解速率快、降解程度高的突变株NK′,其所生产的角蛋白酶可耐高温、高碱环境。
- 严冬李姜函陈欢赵康康颜华贾良辉
- 关键词：诱变育种
- 羽毛降解菌DHW-06的分离鉴定及产酶特性研究被引量：3
- 2021年
- 【目的】从土壤中分离筛选羽毛降解菌株,检测其产酶条件,研究其所产酶的酶学性质,以丰富角蛋白降解的菌株资源。【方法】从土壤样品中,以牛奶培养基和羽毛培养基筛选羽毛降解菌株,失重法测定羽毛降解率,并对筛选菌株进行形态观察、生理生化检测及16S rRNA序列鉴定。筛选菌株于37℃、180 r/min条件下,在以羽毛为唯一碳氮源的培养基中发酵,采用福林酚法测定其角蛋白酶活力,对培养时间(3,6,9,12,15,18,21和24 h)、接种量(体积分数1.5%,3.0%和6.0%)、发酵温度(22,27,32,37和42℃)及培养基初始pH(6.0,6.5,7.0,7.5和8.0)进行优化,并研究温度(30,40,50,60,70和80℃)、pH(6.0,7.0,8.0,9.0和10.0)、金属离子(K^(+),Mg^(2+),Ca^(2+),Fe^(3+),Zn^(2+),Mn^(2+),Cu^(2+)和Ni^(2+))、化学试剂(二硫基苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、十二烷基硫酸钠(SDS)、β-巯基乙醇、异丙醇和二甲基亚砜(DMSO))和不同底物(酪蛋白、角蛋白、牛血清蛋白、牛血红蛋白、天青角蛋白和羽毛粉)对角蛋白酶活力的影响。【结果】从高温处理的土壤样品中筛选到1株羽毛降解菌DHW 06,形态观察、生理生化检测及16S rRNA序列分析初步鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。在培养时间10 h、接种量为体积分数3.0%、发酵温度37℃和培养基初始pH 6.5的条件下发酵,最大酶活力达到129.47 U/mL。酶学特性结果表明,该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为8.0,在30~50℃时具有较好的热稳定性。10 mmol/L的Mn^(2+)使相对酶活力提高300%,10 mmol/L的Cu^(2+)使相对酶活力提高120%;而1 mmol/L的Zn^(2+)使相对酶活力丧失12%,1 mmol/L的Fe3+使相对酶活力丧失53%。体积分数为10%的β巯基乙醇使相对酶活力提高1658.95%,10 mmol/L的DTT使相对酶活力提高577.99%;而10 mmol/L的PMSF使相对酶活力丧失35.88%。该酶具有广泛的底物适应能力,对角蛋白的降解能力最强。【结论】筛�
- 董萌萌郝鹏泽王佳柳陈欢颜华贾良辉
- 关键词：蜡样芽孢杆菌酶学性质
- 密旋链霉菌Act12遗传转化系统的建立与优化
- 2018年
- 密旋链霉菌(Streptomyces pactum)Act12是分离自黄土高原的1株多效放线菌,具有良好的生防应用价值,为了深入研究与利用,需建立该菌株的高效遗传转化系统。本试验以整合型质粒pSET152为出发质粒,大肠杆菌S17-1为供体,Act12的孢子为受体时,在改良2CMY培养基上进行接合转移,孢子预萌发条件为50℃热激10min,阿普霉素质量浓度为10.0mg/L,覆盖时间为18h,转化效率达到2.079×10^(-5)。以抗阿普霉素基因为目的基因,通过PCR验证,成功地将质粒pSET152转入到Act12中。同时,利用该转化系统,成功敲出Act12基因组中一可能的负调控转录因子spa0520,并获得了次级代谢图谱明显变化的缺失突变株Δspa0520。所构建的Act12遗传转化系统,为后续对其生防活性机理的研究以及深入开发利用奠定了基础。另外,通过培养基的改良发现,Act12在氮源含有NO-3时产孢丰富,为后续研究提供了思路。
- 李晓霞马怡茗文冰洁舒伟学薛泉宏贾良辉颜华
- 关键词：遗传转化系统
- 基于基因组改组技术的角蛋白酶高产菌株选育研究被引量：3
- 2018年
- 【目的】筛选具有高效角蛋白水解活性的微生物,为提高废弃羽毛中角蛋白资源的利用奠定基础。【方法】采用梯度稀释法,以羽毛作为惟一碳氮源对土样中的产角蛋白酶菌株进行筛选,筛选可高效降解羽毛的细菌。通过菌株的形态、生理生化特性以及16S rDNA序列分析,对菌株进行分类鉴定,并探讨其最适发酵条件。利用硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)对目的菌株进行诱变,确定最适诱变条件,并进行原生质体融合,通过基因组改组选育角蛋白酶高产菌株。【结果】分离筛选到1株具有较强羽毛降解能力的菌株ZJT01,该菌落圆形凸出,革兰氏染色呈阳性,酪素水解、硝酸盐利用、柠檬酸利用等生理生化试验均呈阳性。结合菌株16S rDNA同源序列比对分析,初步鉴定其为节杆菌(Arthrobactersp.)。菌株ZJT01产角蛋白酶的最适发酵温度和时间分别为32℃和72h。其DES最适用量为9μL/mL,诱变时间为20min;NTG的最适合质量浓度是0.6mg/mL,处理时间为15min。原生质体制备的最佳条件为:溶菌酶终质量浓度10 mg/mL,酶解温度37℃,酶解0.5h。经过硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)分别诱变处理,获得角蛋白酶活性提高的菌株DES-2和NTG-2;对其进行3轮基因组改组后,筛选到2株角蛋白酶活性比亲本菌株ZJT01提高了5.48倍的重组菌株,且其产酶活性可稳定遗传。【结论】通过基因组改组技术获得了2株角蛋白酶活性大幅提高的菌株F3-5和F3-6,这2株菌对羽毛的降解效果较亲本菌株ZJT01明显提高,具有较好的应用前景。
- 舒伟学马怡茗李晓霞张晋龙柯欣颜霞颜华贾良辉
- 关键词：角蛋白酶节杆菌属基因组改组
- 角蛋白高效降解菌Fea-10的筛选与鉴定被引量：4
- 2017年
- 采用透明圈和完整羽毛降解相结合的方法,从养鸡场长期堆积废羽毛中分离出了一株能高效降解羽毛角蛋白的菌株Fea-10.经16S rDNA序列分析表明,Fea-10属于链霉菌属,与微白黄链霉菌的相似性达99.86%.经形态、生理生化和系统发育树综合鉴定,命名为微白黄链霉菌Fea-10.Fea-10全基因组大小约为7.25 Mb,GC含量为73.36%,其含有丰富的次级代谢产物基因簇.菌株Fea-10发酵培养36 h后角蛋白酶活性达到最高值,最佳培养温度为35℃.
- 颜华柯欣吴佳杨文翰刘亚勇贾良辉马怡茗
- 关键词：角蛋白酶菌株筛选
