闫晓平
- 作品数：6 被引量：16H指数：3
- 供职机构：河北农业大学植物保护学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家现代农业产业技术体系建设项目河北省自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 美国白蛾几丁质脱乙酰酶2a(HcCDA2a)的克隆表达与酶活测定
- 利用RACE-PCR方法,扩增得到编码美国白蛾Hyphantria cunea Drury几丁质脱乙酰酶基因HcCDA2a.将该基因分别在大肠杆菌BL21和昆虫细胞BTI-Tn-5B1-4 (HighFive)中表达.经...
- 闫晓平王伟张雅昆郭巍赵丹陆秀君郜玉杰赵坤莉
- 关键词：美国白蛾
- 美国白蛾几丁质脱乙酰酶的克隆、表达及酶学性质被引量：9
- 2017年
- 【目的】研究美国白蛾(Hyphantria cunea)几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因的酶学性质,了解其在昆虫生命过程中如何发挥功能,为美国白蛾的生物防治提供新靶标。【方法】对家蚕(Bombyxmori)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和云杉卷夜蛾(Choristoneura fumiferana)3种鳞翅目昆虫的几丁质脱乙酰酶2序列保守域进行分析,采用同源比对方法,设计几丁质脱乙酰酶2基因特异引物,利用PCR扩增该基因全长c DNA序列;构建原核重组表达载体p ET30a-Hc CDA2,克隆获得编码美国白蛾Hc CDA2的基因,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测;构建重组杆状病毒表达载体p Fast Bac-Hc CDA1和p Fast Bac-Hc CDA2,脂质体转染法转染昆虫细胞Hi5,分别获得P1、P2、P3病毒,收集P3病毒上清,得到美国白蛾Hc CDA1(前期研究所得)和Hc CDA2重组蛋白,Western blot分析;重组蛋白Hc CDA1和Hc CDA2经硫酸铵粗纯化后,以对硝基乙酰苯胺为底物,测定重组几丁质脱乙酰酶Hc CDA1&2的酶活力,对其最适反应温度、最适p H以及金属离子的影响等酶学性质进行研究。【结果】获得了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因全长c DNA序列,命名为Hc CDA2(Gen Bank登录号:KT781841),基因全长1.6 kb,该基因在大肠杆菌中成功表达61 kD目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性多克隆抗体。Western blot分析结果表明,Hc CDA1和Hc CDA2在昆虫细胞(Hi5)中均成功表达约80 k D蛋白。酶学性质研究表明,昆虫细胞中分泌表达的Hc CDA1和Hc CDA2均具有催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,当温度达到80℃时,Hc CDA2几乎失去酶活力;Hc CDA1酶促反应适宜的p H范围为7.0—9.0,并且Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应的最适p H均为8.0;在最适反应条件下,Hc CDA2蛋白酶活力均高于Hc CDA1蛋白酶活力;Mg^(2+)、Zn^(2+)、Mn^(2+)和Ca^(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应整体呈抑制趋势,随浓度增大,Zn^(2)+对Hc CDA1抑制作用逐渐增强,而Mg^(2+)对
- 闫晓平赵丹郭巍王伟张雅昆郜玉杰赵坤莉
- 关键词：美国白蛾克隆表达酶学性质
- 暗黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HpCDA5基因的细胞表达及活性分析被引量：3
- 2018年
- cdsRDNA文库免疫筛选到编码暗黑鳃金龟幼虫几丁质脱乙酰酶HpdsRCDA5基因,序列分析表明HpdsRCDA5含有1个几丁质脱乙酰酶结构域,属于GroupdsRV类CDA蛋白。构建重组杆状病毒表达载体pdsRFastdsRBac-HpdsRCDA5,转染昆虫细胞sf9,WesterndsRblot分析表明HpdsRCDA5在昆虫细胞sf9中成功表达42dsRkdsRDa的蛋白。利用qdsRRT-PCR方法分析HpdsRCDA5基因组织表达,结果显示HpdsRCDA5基因在中肠中表达最高,为中肠特异表达蛋白。几丁质结合活性表明HpdsRCDA5蛋白只能被强洗脱剂洗脱,具有很强的几丁质结合活性。本研究通过对暗黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HpdsRCDA5的生化特性研究,为进一步明确HpdsRCDA5的生理功能提供理论依据,并为以HpdsRCDA5蛋白为靶标的暗黑鳃金龟生物防治提供支撑。
- 赵丹闫晓平陆秀君郭巍
- 关键词：暗黑鳃金龟细胞表达组织表达分析
- 甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶1(SeCDA1)在毕赤酵母中的表达与活性测定被引量：2
- 2015年
- 利用RACE-PCR方法,扩增得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰基酶基因secda1。将secda1基因插入到载体p PIC9K多克隆位点,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,得到重组质粒p PIC9K-secda1。重组质粒经线性化后,电击转化缺陷性毕赤酵母GS115感受态细胞,构建含有目的基因的重组酵母菌株。经甲醇诱导表达,Western blot分析后表明secda1基因在毕赤酵母GS115中成功表达80 k Da蛋白。脱乙酰基酶活性测定结果显示重组蛋白酶活力为1.35 U/m L。利用RT-PCR对该基因进行m RNA水平上的表达分析,结果表明secda1在幼虫取食期的头、表皮、中肠、马氏管、脂肪体及蛹期虫体均有表达;本研究利用毕赤酵母成功表达具有酶活力的重组Se CDA1蛋白,为进一步明确Se CDA1蛋白的生理功能提供条件,并为以Se CDA1蛋白为靶标更有效地防治甜菜夜蛾提供理论依据。
- 孙晓彤赵丹闫晓平郭巍徐大庆李少雅李景
- 关键词：甜菜夜蛾毕赤酵母
- Bt Cry8Ea蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫(Holotrichia oblita)中肠微生物菌群的影响被引量：1
- 2017年
- Bt Cry8Ea蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫有特异的杀虫活性,通过中肠微生物宏基因组分析研究了Bt Cry8Ea蛋白与华北大黑鳃金龟幼虫中肠微生物的相互作用。解剖正常饲喂和饲喂Cry8Ea蛋白的华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita二龄幼虫中肠,提取中肠微生物宏基因组DNA,构建16S rDNA文库。利用PCR-RFLP方法分析两个处理中肠微生物16S rDNA酶切片段多态性(MspⅠ,RsaⅠ和HaeⅢ内切酶),不同克隆测序后与NCBI数据库进行对比分析,构建系统进化树,确定中肠微生物种属。结果显示,正常饲喂的华北大黑鳃金龟幼虫中肠微生物共检出30种细菌,优势菌群为变形菌门(Proteobacteria):(Desulfosporosinus,29.63%);厚壁菌门(Firmicutes):梭菌属(Clostridium,12.59%)和芽孢杆菌属(Bacillus,10.37%),而饲喂Cry8Ea蛋白的华北大黑鳃幼虫中共检出4种细菌,优势菌群为厚壁菌门(Firmicutes):肠球菌属(Enterococcus,50%)和链球菌属(Streptococcus,46.88%)。结果表明,饲喂Cry8Ea蛋白后,中肠微生物的菌群结构发生了明显变化。
- 王伟赵丹郭巍李新娜张雅昆闫晓平
- 关键词：华北大黑鳃金龟BTPCR-RFLP
- 美国白蛾几丁质脱乙酰酶1(HcCDA1)的克隆表达与酶活测定被引量：3
- 2015年
- 利用RACE-PCR方法,扩增得到编码美国白蛾Hyphantria cunea Drury几丁质脱乙酰酶基因Hc CDA1。将该基因分别在大肠杆菌BL21和毕赤酵母细胞Pichia pastoris GS115表达。经诱导表达后,Western blot分析表明Hc CDA1在大肠杆菌中成功表达61.8 k D的蛋白,符合预期大小;在毕赤酵母GS115中成功表达80 k D蛋白。酶活性试验显示酵母细胞中表达的重组蛋白酶活力为1.685 U/m L。本研究利用毕赤酵母成功表达具有酶活力的重组Hc CDA1蛋白,为进一步明确该蛋白的生理功能提供条件。
- 闫晓平赵丹孙晓彤郭巍李少雅李景
- 关键词：美国白蛾
