武爱华
- 作品数：16 被引量：10H指数：2
- 供职机构：江苏省农业科学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省自然科学基金博士科研启动基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学环境科学与工程理学更多>>
- 抗-Cry2Aa单链抗体分子互作及荧光免疫检测研究
- 2017年
- Cry2Aa毒素是一种新型生物农药,分析该毒素与特异性单链抗体分子互作,并建立快速检测毒素残留的方法对保障食品和生态安全有重要意义。本研究以同源蛋白为模板对单链抗体进行建模,并进行了Cry2Aa毒素与单链抗体的分子对接模拟,确定关键结合位点,以此为基础将单链抗体作为检测抗体,建立了间接竞争时间分辨荧光免疫分析方法,对大米样品中Cry2Aa毒素进行了检测。利用生物信息学工具模拟获得单链抗体三维结构模型,分子对接结果显示重链可变区81NY82和121SGNY124区域及轻链可变区的245YSSN248氨基酸残基在与毒素结构Ⅱ区识别过程中起关键作用,为建立高效检测方法奠定基础,进一步基于该单链抗体建立的时间分辨检测方法灵敏度(IC10)为0.08 ng/m L,中抑制浓度(IC50)为7.99 ng/m L,线性检测范围(IC20~IC80)为0.24~263.77 ng/m L,且与常规双抗夹心ELISA法检测呈良好线性关系。
- 王耘武爱华张存政刘贤金
- 关键词：单链抗体时间分辨荧光免疫分析同源模建
- 一种人源杀虫基因及其编码杀虫肽与应用
- 本发明公开一种人源杀虫基因及其编码杀虫肽与应用，所述人源杀虫基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的杀虫肽氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该杀虫肽可经原核系统表达，初级培养物具有与稻纵卷叶螟中肠围...
- 刘贤金刘媛谢雅晶武爱华张霄徐重新赵岩岩仲建锋
- 一种人源杀虫蛋白及其制备方法与应用
- 本发明公开一种人源杀虫蛋白，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；该人源杀虫蛋白是由抗Cry1B毒素独特型单链抗体C7定向突变形成饱和突变库后应用噬菌体展示技术筛选获得；其...
- 刘贤金仲建锋徐重新张霄刘媛张存政何鑫武爱华
- 文献传递
- 一种具有杀虫活性的猪源化改型抗体及其制备方法与应用
- 本发明涉及一种具有杀虫活性的猪源化改型抗体及其制备方法与应用，通过生物信息学预测猪源化抗体重、轻链可变区的8个FR，并植入抗独特型单链抗体A12的6个CDR来确定猪源化改型抗体的序列，进行人工合成，从而构建A12的猪源化...
- 刘贤金仲建锋张霄刘媛何鑫胡晓丹武爱华徐重新谢雅晶梁晓林曼曼
- 文献传递
- 一种具有杀虫活性的牛源化改型抗体及其制备方法与应用
- 通过生物信息学预测牛源化抗体重、轻链可变区的8个FR，并植入抗独特型单链抗体A12的6个CDR来确定牛源化改型抗体的序列，进行人工合成，从而构建A12的牛源化的改型抗体bovine‑A12‑PUC57，并通过替换易于噬菌...
- 刘贤金仲建锋张霄刘媛何鑫胡晓丹武爱华徐重新谢雅晶梁晓林曼曼
- 文献传递
- 小菜蛾碱性磷酸酯酶受体表达与分子模拟被引量：2
- 2016年
- 【目的】利用原核表达小菜蛾(Plutella xyllostella)中肠膜结合碱性磷酸酯酶(membrane-bound alkaline phosphatase,mALP)并经Ligand blot验证其具有与Cry1Ac毒素结合的能力;通过同源建模和分子对接研究Cry1Ac-mALP的结合模式,预测毒素和受体结合区域及关键氨基酸位点(热点残基),为了解毒素-受体互作机制及分子改造增强Cry毒素活性的研究打下基础。【方法】针对小菜蛾mALP全长设计引物,并以小菜蛾c DNA为模板扩增mALP基因,双酶切后用T4连接酶连接至pET-26b原核表达载体,将构建的pET-26b-mALP载体转化Trans1-T1克隆感受态,挑取克隆并提取质粒后进行PCR、双酶切和测序验证,将验证无误的重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达感受态细胞,进行诱导表达。将诱导表达后的mALP转至PVDF膜上,通过Western blot和Ligand blot分别验证mALP是否成功表达以及是否具有与Cry1Ac毒素结合的能力。对mALP进行同源建模、分子动力学模拟以及模型评价,获得的mALP最佳三维结构与Cry1Ac毒素利用Patch DOCK和Fire Dock程序进行分子对接试验,对确定的最佳毒素-受体复合物进行结合区域和结合氨基酸位点分析,并通过计算机辅助的丙氨酸突变扫描试验确定毒素和受体参与的关键氨基酸残基。【结果】扩增出小菜蛾mALP基因并克隆至pET-26b原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)表达感受态后挑取阳性克隆提取质粒后进行PCR、双酶切和测序均显示构建正确。通过原核表达和Western blot验证成功表达了mALP蛋白,并经Ligand blot试验证实了原核表达的mALP具有和Cry1Ac毒素结合的能力。利用同源建模成功获得了mALP的三维结构,通过Patch DOCK和Fire Dock分子对接程序,获得毒素和受体的对接复合物,通过溶剂可及表面积变化计算和Ligplot分析,确定毒素结构域Ⅱ和结构域Ⅲ均参与了受体结合,并且毒素和受体均以疏水结合和氢键结合模式参与结合,最后通过热�
- 张霄胡晓丹仲建锋武爱华徐重新刘媛张存政谢雅晶刘贤金
- 关键词：原核表达同源建模分子对接
- Cry2Aa毒素结合十二肽的筛选与鉴定被引量：2
- 2015年
- 利用Cry-2Aa毒素蛋白对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮筛选，并从第4轮筛选产物中随机挑选20个单克隆，进行单克隆ELISA、PCR扩增、DNA电泳及测序，鉴定这些克隆与Cry2Aa毒素的结合活性。结果显示，这20个克隆均能与c巧也Aa毒素发生特异性结合，并推导出8条不同的序列。挑取阳性值最高的克隆GT（氨基酸序列为GTPWHHHRHLIV）建立了基于十二肽的Cry-2Aa毒蛋白的间接竞争ELISA检测方法。该方法的抑制中浓度（IC50）为1｜1390μg／ml，最低检测限IC10为O．0211μg／ml，线性检测范围为0．0478～22.691Oμg／ml（Y=23．09lgx＋48．692，R^2=0．9963）。噬菌体展示肽库筛选方法为快速、准确地检测Cry2Aa毒蛋白提供了新的途径。
- 武爱华张霄刘媛赵扬赵岩岩张存政谢雅晶刘贤金
- Bt Cry1类毒素共性结构域的分析、表达及鉴定被引量：1
- 2016年
- 【目的】分析定位Bt Cry1类毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F的共性结构域,克隆并表达共性结构域蛋白,为筛选Bt毒素广谱抗体及建立广谱检测方法打下基础。【方法】利用生物信息学和分子模拟技术,通过SWISS-MODEL同源建模分别对5种Cry1类毒素进行三维建模,并结合Ramachandran plot、ERRAT和Verify3D方法评价模型构象的合理性。通过分析比对5种Cry1类毒素的三维结构,确定DomainⅠ区域作为5种Cry1毒素的共性结构域。以含Cry1Ac基因的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种为模板设计引物,PCR扩增获得共性结构域DomainⅠ基因,将其经NcoⅠ和NotⅠ双酶切连接至原核表达载体pET-26b(+),构建原核表达载体pET-26b-DomainⅠ。重组质粒经菌液PCR、双酶切以及测序鉴定验证正确后,转化至E.coli BL21(DE3),经终浓度为1 mmol·L^(-1)的IPTG在20℃下诱导表达16h后检测共性结构域蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用His-Trap HP镍亲和柱纯化上清中的可溶性融合蛋白,经SDS-PAGE电泳、Western blot和ELISA试验验证纯化的共性结构域蛋白的生物活性。【结果】基于氨基酸序列及三维空间比对分析,发现5种Cry1类毒素的DomainⅠ的序列一致性最高,而且它们的DomainⅠ三维结构几乎完全重合,确定DomainⅠ区域作为5种Cry1毒素的共性结构域,通过PCR、双酶切及测序鉴定成功构建原核表达载体pET-26b-DomainⅠ,经IPTG诱导表达、His-Trap HP镍亲和柱纯化获得了可溶性的DomainⅠ共性结构域蛋白,SDS-PAGE和Western blot证实表达的共性结构域蛋白的分子量约为33.4 kD,且能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应,ELISA试验证实共性结构域蛋白与5种Cry1类毒素特异性抗体均具有很强的结合能力,抗原表位分析结果显示共性结构域蛋白具有和完整的Cry蛋白存在�
- 刘贝贝张霄谢雅晶焦凌霞刘媛张存政赵岩岩武爱华刘贤金
- 关键词：BT原核表达纯化
- 一种人源杀虫蛋白及其制备方法与应用
- 本发明公开一种人源杀虫蛋白，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；该人源杀虫蛋白是由抗Cry1B毒素独特型单链抗体C7定向突变形成饱和突变库后应用噬菌体展示技术筛选获得；其...
- 刘贤金仲建锋徐重新张霄刘媛张存政何鑫武爱华
- 文献传递
- 有机磷农药广谱抗原表位多肽的制备及应用
- 2017年
- 利用噬菌体展示技术,以广谱型单克隆抗体筛选十二肽噬菌体展示库,获得能够模拟有机磷类农药抗原表位的十二肽,建立了一种间接竞争ELISA方法用于检测多种有机磷类农药。结果表明,获得的特异性多肽氨基酸序列为HPAPDHSSQSHQ,呈现出较好的抗原性、亲水性及表面可及性,可广谱模拟有机磷农药抗原表位。所建立的间接ELISA方法对有机磷农药通用结构半抗原(BPB)的IC50和IC10分别为1.776μg/ml及0.358μg/ml,与对硫磷、蝇毒磷、乙拌磷、辛硫磷、喹硫磷和三唑磷的交叉反应率分别为58.74%、44.93%、52.03%、43.98%、36.82%和4.87%。建立的检测方法具有绿色、广谱、高效的特点,是一种新型有机磷类农药累积毒性检测技术。
- 赵扬武爱华张霄莫海珍张存政刘贤金胡梁斌
- 关键词：间接竞争ELISA
