桂芳
- 作品数：8 被引量：6H指数：2
- 供职机构：武汉生物制品研究所更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项“重大新药创制”科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 表达全人源抗人IgE单抗的细胞株构建及筛选被引量：2
- 2015年
- 目的:构建及筛选高效表达原创性全人源抗人Ig E单克隆抗体的重组工程细胞株。方法:将采用核糖体展示技术筛选到的原创性全人源抗人Ig E单链抗体(sc Fv)基因改构设计为Ig G1κ型全长抗体,构建重组真核表达质粒并电转染CHO-S细胞,Dot-blot法选取多株高表达克隆进行40ml摇瓶批次培养,再据细胞生长特征及抗体表达量选取高表达克隆进行40ml摇瓶及3L摇瓶流加培养研究,选取候选细胞株并对改构前后抗体的生物学活性进行比较研究。结果:成功构建了p MH3-H、p MH3-L、p CApuro-H、p CApuro-L四种重组真核表达质粒并成功共转染CHO-S细胞。完成了4次电转染8轮细胞克隆筛选,获得两株表达量较高的候选克隆Mab1#和Mab2#,在3L摇瓶流加培养中抗体表达量分别达到470mg/L及499mg/L。生物膜光干涉技术(Bio-Layer Interferometry,BLI)亲和力结果显示Mab1#及Mab2#两株单抗亲和力均达到nmol/L级(10-9),与现有唯一上市的抗人Ig E单抗药物奥马珠单抗(Omalizumab)的亲和力相当。选取Mab1#全长抗体与其改构前的母本单链抗体的表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)中和活性比较结果显示Mab1#抑制h Ig E与FcεRI结合的EC50为3nmol/L,EC90为9nmol/L,较改造前亲和力提高了4.3倍,中和活性(EC50)提高了23.7倍,中和活性(EC90)提高了41.3倍。结论:成功将表达原创性全人源抗人Ig E的单链抗体(约25k Da)改造为亲和力及中和活性均大幅提升的全长抗体(约150k Da),获得2个候选细胞株。
- 张银川刘萌萌张雅婷桂芳张爱华闭兰潘勇兵
- 关键词：单克隆抗体细胞株
- 抗人TNF-α单克隆抗体液质联用肽图分析方法的建立及验证被引量：4
- 2017年
- 目的:建立液相色谱-质谱联用肽图分析方法用于抗人肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)单抗的专属性鉴别。方法:TNF-α单抗样品经盐酸胍变性、还原,释放出的游离半胱氨酸残基进行烷化,还原剂中和过量的烷化剂。超滤置换酶切缓冲液后进行胰酶酶切并终止。色谱条件:采用Waters UPLC BEH 300 C_(18)(2.1 mm×150mm,1.7μm)色谱柱,以0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)为流动相,梯度洗脱(5-120 min,2%B→45%B),流速为0.2 mL·min^(-1),检测波长为214 nm;质谱条件:采用电喷雾离子源及正离子模式,数据采集范围m/z为100~1990。结果:TNF-α单抗重链及轻链的6个互补决定区(CDR)对应肽段由质谱鉴定出,HC CDR2及HC CDR3在色谱峰图中共流出;利妥昔单抗用于评估本方法的专属性,结果显示本方法专属性强,且不受基质的干扰;选定m/z 1 344(M^(+5))的色谱峰为参考峰,根据CDR的相对保留时间考察该方法的变异程度,5次重复测定CDR相对保留时间的RSD在0.57%~1.19%之间;中间精密度考察测定的相对保留时间的RSD在0.00%~1.08%之间;胰酶酶切比例在20:1~30:1,酶切时间在17~23h范围内变化时,相对保留时间的均较小,符合方法耐用性的要求;样品消化后在8℃储存24h以及-20℃储存5d的稳定性良好。结论:基于CDR相关肽段鉴别的液质联用肽图分析方法可定性鉴定出TNF-α单抗,方法学验证结果显示该方法适用于抗人TNF-α单抗的专属性鉴别,可用于其质量控制及批检验放行。
- 桂芳杨兰兰潘勇兵张雅婷张银川
- 关键词：单克隆抗体液质联用
- 全人源化抗人TNF-α单克隆抗体毛细管区带电泳鉴别方法的建立及验证
- 2016年
- 目的建立及验证用于全人源化抗人TNF-α(Tumor necrosis factor-α)单克隆抗体(简称抗人TNF-α单抗)鉴别的毛细管区带电泳(Capillary zone electrophoresis,CZE)方法。方法采用DB-1毛细管,以样品检测分离度、迁移时间、电流及峰形为判断标准,筛选CZE过程中的各种参数(缓冲液p H、ε-氨基乙酸浓度、乙酸钠浓度、羟丙基纤维素浓度、样品稀释剂、进样时间及运行电压等),建立CZE方法,并对方法的专属性、精密度、中间精密度进行验证。结果建立的CZE方法参数条件为:缓冲液p H为5.0,EACA浓度为300 mmol/L,乙酸钠浓度为20 mmol/L,HPMC质量分数为0.05%,用50 mmol/L Tris稀释样品,进样时间为15 s,运行电压为20 k V。样品制备重复性主峰迁移时间RSD为0.459%,中间精密度RSD为1.145%。结论 CZE方法分离度高、专属性强、重复性和精密度好、简单快速,可作为全人源化抗人TNF-α单抗的鉴别方法。
- 杨兰兰桂芳张银川张雅婷潘勇兵闭兰吴小丽
- 关键词：人肿瘤坏死因子Α单克隆抗体毛细管区带电泳
- 表达全人源抗人IgE单抗的候选细胞株鉴定及筛选
- 2015年
- 目的:鉴定及筛选表达原创性全人源抗人Ig E单克隆抗体的候选工程细胞株。方法:对实验室前期筛选到的Mab1#及Mab2#2个候选细胞株的3 L摇瓶流加培养12 d并经Protein A一步柱层析纯化的抗体样品,进行紫外光谱全波长扫描,采用LC-MS测定精确相对分子质量进行鉴别,采用SDS-PAGE(还原型及非还原型)进行分子完整性分析,采用SEC-HPLC进行集聚倾向性分析,采用IEF进行等电点(p I)测定及对N-糖苷酶(PNGase F)酶切前后样品的电荷进行比较分析,采用CEX-HPLC进行电荷异质性分析。同时,对Mab1#及Mab2#2个候选细胞株的3个月传代稳定性进行比较研究。结果:Mab1#及Mab2#2个候选细胞株表达抗体的紫外最大吸收波长均为280 nm;LC-MS轻链相对分子质量分别为23 464.82和23 465.06,重链(G0F糖型)相对分子质量分别为50 807.50 Da和50 807.48 Da,均与理论预期相符;SDS-PAGE(还原型及非还原型)电泳结果显示表达的抗体分子完整性好;SEC-HPLC聚集倾向分析显示2株单抗经一步Protein A亲和柱层析后的可溶性聚合体的含量均小于2%;IEF结果显示Mab1#和Mab2#p I分别为8.38和8.44,PNGase F酶切前后未见明显的由于糖基化修饰引起的电荷变异体。CEX-HPLC结果显示2株单抗的电荷均一性好,酸性变体及碱性变体含量之和均小于4%。完成的3个月细胞株稳定性研究结果显示Mab1#及Mab2#2株克隆均稳定。结论:Mab1#及Mab2#2个候选细胞株具有相似的目标抗体表达量、表达抗体的质量(分子完整性、聚集倾向、电荷异质性、亲和力)、以及细胞稳定性特征和细胞生长代谢特征等质量属性,均符合制定的阶段筛选目标。
- 张银川潘勇兵刘萌萌桂芳张雅婷张爱华闭兰
- 关键词：细胞株
- 全人源抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体毛细管等电聚焦鉴别方法的建立及验证
- 2016年
- 目的建立用于全人源抗人肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体鉴别的毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing,c IEF)方法,并进行验证。方法通过优化c IEF过程中各关键实验参数,如阴极稳定剂浓度、阳极稳定剂浓度、两性电解质浓度、3-10与8-10.5两性电解质比例、聚焦时间、聚焦电压,建立c IEF方法,并对方法的专属性、重复性、中间精密度进行验证。结果确定c IEF方法的实验参数为:阴极稳定剂浓度30 mmol/L,阳极稳定剂浓度3.2 mmol/L,3-10两性电解质在样品溶液中体积比为6.0%,聚焦电压为25 k V,聚焦时间为10 min。保护剂在样品出峰时间无紫外吸收峰,阳性对照阿达木单抗与样品出峰时间及峰形一致,阴性对照利妥昔单抗生物类似药、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗生物类似药、西妥昔单抗与样品出峰时间及峰形均不一致,且对样品无干扰;样品制备重复性主峰等电点的相对标准差(relative standard deviation,RSD)为0.114%,中间精密度RSD为0.837%。结论建立的c IEF方法 p H梯度和精密度良好,专属性较强,适用于制品的批放行鉴别试验。
- 杨兰兰张银川吴小丽张雅婷桂芳吴师师闭兰潘勇兵
- 关键词：肿瘤坏死因子-Α单克隆抗体
- 抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体体外生物学活性检测方法的优化及验证
- 2015年
- 目的优化抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体体外生物学活性的检测方法,并进行验证。方法对TNF-α单克隆抗体体外生物学活性检测方法中的结晶紫染色液浓度、细胞浓度、放线菌素D(Act D)浓度及TNF-α杀伤浓度进行优化,并对该方法的精密度及专属性进行验证。绘制质量控制图,对抗TNF-α单克隆抗体样品进行20次重复检测。结果结晶紫染色液、细胞浓度、Act D和TNF-α的最适浓度分别为0.2%、1.5×105个/ml,1 ng/ml和0.8μg/ml。同一人员于不同日6次重复测定参考品的半数有效浓度(ED50)均值为(44.18±6.858)ng/ml,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为15.522%;不同日由3位不同人员重复测定参考品的ED50均值为(41.19±3.05)ng/ml,RSD值为7.40%;在TNF-α浓度一定的情况下,随着抗TNF-α单克隆抗体和阳性对照Humira浓度的降低,细胞的存活率随之降低,其他抗体无此现象。抗TNF-α单克隆抗体样品的20次测定结果均成立。结论成功优化了抗TNF-α单克隆抗体体外生物学活性检测方法的条件,该方法具有良好的精密度及专属性。
- 潘勇兵张雅婷张银川宋桂芝桂芳闭兰
- 关键词：肿瘤坏死因子-Α单克隆抗体生物学活性
- 应用小鼠肝坏死模型分析重组全人源抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的体内中和活性
- 2015年
- 目的建立小鼠肝坏死模型,分析重组全人源抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体的体内中和活性。方法确定D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-Gal N)的致敏时间及TNF-α对C57BL/6小鼠的致死剂量;采用D-Gal N致敏小鼠,经腹腔注射TNF-α建立小鼠肝坏死模型,并测定3批供试品(抗TNF-α单抗)和3批阳性对照(阿达木单克隆抗体注射液)的体内中和活性,采用Probit回归拟合对活性测定结果进行分析。结果确定DGal N的致敏时间为10 min;TNF-α的致死剂量为100μg/kg体重;Probit回归拟合分析显示,拟合度较好,3批供试品对C57BL/6小鼠的半数有效剂量(ED50)分别为0.505、0.434和0.609 mg/kg,3批阳性对照对C57BL/6小鼠的ED50分别为0.455、0.571和0.484 mg/kg,供试品与阳性对照对C57BL/6小鼠的体内中和活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论联合应用D-Gal N和TNF-α可造成小鼠肝坏死,从而导致小鼠死亡,抗TNF-α单抗可阻断其效应。抗TNF-α单抗对TNF-α的抑制作用呈剂量-效应关系。
- 张雅婷潘勇兵张银川张坤明任彬宋桂芝桂芳闭兰
- 关键词：肿瘤坏死因子-Α中和活性
- 竞争ELISA法检测抗新型冠状病毒RBD单抗阻断活性方法的建立及验证
- 2020年
- 目的:建立竞争ELISA法测定抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2) RBD单克隆抗体对RBD与ACE2蛋白结合的阻断活性,并对方法进行验证,同时与蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)测得的活病毒中和活性进行比较及相关性分析。方法:以RBD-Fc为包被抗原,加入ACE2-His和抗SARS-CoV-2 RBD单抗,两者竞争性结合RBD,使用辣根过氧化酶标记的抗6×His抗体作为二抗,建立检测抗SARS-CoV-2 RBD单抗阻断RBD与其受体ACE2结合的竞争ELISA法,并对该方法进行专属性、相对准确度、精密度、线性和范围的验证。采用该方法对7株SARS-CoV-2单抗阻断活性进行检测,并将结果与PRNT法检测结果进行比较及相关性分析。结果:建立的竞争ELISA法能有效检测抗SARS-CoV-2 RBD单抗阻断RBD与ACE2蛋白结合的作用,其阻断能力存在量效关系,且符合四参数方程;理论效价为64%,80%,100%,125%,156%的样品测定10次,相对偏倚均在±20%范围内;以效价理论值的对数(横坐标)对其相应的效价测定值的对数(纵坐标)作直线回归,回归方程为y=1.156x-0.021 3,斜率在0.8~1.25之间,相对准确度良好。每个效价水平相对效价测定值的几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)分别为2.6%,5.2%,3.6%,3.4%和10.2%,均<20%,精密度良好;直线回归方程相关系数为0.985,线性符合要求。本方法相对准确度、中间精密度和线性均符合要求的效价水平范围为64%~156%。7株SARSCoV-2 RBD单抗的检测结果与PRNT法检测结果具有较好的相关性。结论:成功建立了抗SARS-CoV-2 RBD单抗竞争ELISA的检测方法,该方法具有良好的专属性、相对准确度、精密度和线性,并与PRNT法检测结果具有较好的相关性,可用于间接评价相关SARS-CoV-2单抗对活病毒的中和活性。
- 潘勇兵张囡詹珊珊桂芳王炯宋刚吴小丽杨晓明
- 关键词：新型冠状病毒单克隆抗体竞争ELISA
