吴斌文
- 作品数：14 被引量：40H指数：4
- 供职机构：广东省人民医院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划广东省科技计划工业攻关项目广东省自然科学基金更多>>
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- 融合自杀基因FCU1真核表达载体的构建与表达
- 2004年
- 目的 构建含有融合自杀基因FCU1的真核细胞表达载体 pEGFP FCU1,并转染肝癌细胞SMMC772 1,初步探讨FCU1/ 5 氟胞嘧啶 (5 FC)系统对体外培养细胞的生长抑制作用。方法 用SmaⅠ ,XhoⅠ两种限制性内切酶分别切割质粒 pEGFP C1和 pCIneoFCU1,所得载体片断和目的基因片断连接后转化 ,阳性重组子转染肝癌细胞SMMC772 1,以绿色荧光蛋白基因为报告基因 ,用G4 18筛选出阳性细胞克隆后 ,进行体外药物敏感实验。结果 酶切鉴定重组子阳性克隆率约为 6 0 % ,转染成功的细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光 ;转染的细胞在 5 FC作用下其生长抑制率明显高于未转染细胞的生长抑制率 ,且旁观者效应显著。结论 自杀基因FCU1真核表达载体构建正确 ,转染细胞成功并获稳定表达 ,FCU1/ 5 FC系统对肝癌细胞SMCC772 1具有实验性的基因治疗作用。
- 谢娜林菊生吴斌文黎培员孔心涓宋东坡
- 关键词：融合自杀基因真核表达基因表达耐药性
- FCU1重组腺病毒载体构建及对结肠癌细胞的杀伤作用
- 2008年
- 目的:构建含融合自杀基因FCU1的重组腺病毒载体,转染293细胞构建重组腺病毒,并感染结肠癌细胞,同时给以前体药物5-FC,观察其对结肠癌细胞的杀伤作用.方法:将FCU1基因采用EcoRⅠ、SalⅠ双酶切克隆至穿梭质粒pDC316,构建质粒pDC316-FCU1,并酶切和测序鉴定.pDC316-FCU1与骨架质粒pBHG经脂质体共转染HEK293细胞,在HEK293细胞中同源重组并包装重组腺病毒Ad5-FCU1.将Ad5-FCU1感染结肠癌细胞HCT116,同时给以前体药物5-FC,MTT法检测5-FC对HCT116杀伤作用.结果:重组质粒pDC316-FCU1构建成功.pDC316-FCU1与骨架质粒pBHG共转染HEK293细胞后,出现明显的毒斑,纯化后病毒滴度为2×1012PFU/L.重组病毒Ad5-FCU1感染HCT116细胞后,给以无毒前体药物5-FC显示极强的杀伤作用,当5-FC达100μmol/L时,存活的HCT116/FCU1细胞极少,而对照组存活率接近90%.结论:成功构建了含融合自杀基因FCU1的Ad5-FCU1重组腺病毒,FCU1/5-FC自杀基因系统对结肠癌细胞具有显著的体外杀伤作用.
- 吴斌文李友佳张凯军李东风曾志刚张瑛华耿庆山
- 关键词：结肠癌融合自杀基因基因治疗
- 结直肠癌中AEG-1对血管生成相关因子HIF-1α和miR-34a的影响被引量：3
- 2014年
- 目的:构建携带星形胶质细胞升高基因-1(astrocyte elevated gene-1,AEG-1)的慢病毒载体并进行慢病毒包装,感染结直肠癌SW1116细胞建立稳定株,检测AEG-1改变后对血管生成相关因子缺氧诱导因子-1α(hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α)和miR-34a表达的影响.方法:采用Western blot方法筛选合适的结直肠癌细胞株;构建携带AEG-1的慢病毒载体,经PCR筛选阳性克隆及测序鉴定后,用psPAX、pMD2.G慢病毒包装系统共转染包装细胞293FT,包装产生慢病毒,用以感染筛选出来的结肠癌细胞,细胞提取mRNA和蛋白进行qRT-PCR和Western blot分析验证细胞模型建立是否成功.分别采用qRT-PCR和Western blot检测miR-34a和HIF-1α在AEG-1转染前后的表达变化情况.结果:蛋白质印迹结果显示SW1116在7个结直肠癌中的表达量最低(P<0.05);成功构建AEG-1的慢病毒载体,对结肠癌SW1116细胞株AEG-1表达的上调作用显著(0.53±0.44vs 2.02±0.22,P<0.05;0.71±0.14 vs 2.02±0.22,P<0.05),上调AEG-1的表达会抑制miR-34a(P<0.01)和促进HIF-1α(P<0.01)的表达.结论:成功构建AEG-1慢病毒载体,AEG-1在结直肠癌中可以抑制血管生成相关因子miR-34a和促进HIF-1α的表达,我们推测AEG-1可能通过抑制miR-34a促进HIF-1α的表达,从而发挥促进肿瘤血管新生的作用.
- 黄素军吴斌文李东风刘宝龙邓罡张凯军
- 关键词：MIR-34A缺氧诱导因子-1Α慢病毒结直肠癌
- 钙调蛋白和电压依赖性钙通道在EGF促肝癌细胞生长中的作用被引量：1
- 2004年
- 目的:许多生长因子如表皮生长因子(EGF)与肿瘤的发生密切相关。EGF与表皮生长因子受体(EGFR)结合,通过一系列的信息传导,导致肝癌细胞的增生。但受体后的信息传导机制尚不清楚。本实验探讨酪氨酸激酶、钙调蛋白和电压依赖性钙通道在EGF促肝癌细胞生长中的作用。方法:本研究于无血清RPMI 1640中培养肝癌细胞SMMC7721。采用3H-Thymidine(3H-TdR)掺入的方法,检测肝癌细胞DNA合成速率,研究酪氨酸激酶、钙调蛋白和电压依赖性钙通道在EGF促肝癌细胞生长中的作用。结果:EGF10-9M对肝癌细胞的生长有极显著促进作用,与对照组比较差异有显著意义(P<0.05)。酪氨酸激酶阻滞剂Genistein对EGF的促肝癌细胞生长极显著抑制作用(P<0.001)。钙调蛋白阻滞剂W-7对EGF的促肝癌细胞生长具有极显著抑制作用(P<0.001),而对基础状态细胞的H-TdR掺入值无显著影响(P>0.05)。电压依赖性钙通道阻滞剂Varapamil对EGF的促肝癌细胞生长无显著抑制作用(P>0.05),对基础状态细胞的3H-TdR掺入值亦无显著影响(P>0.05)。结论:结果显示,酪氨酸激酶及依赖钙-钙调蛋白途径在EGF的作用中起关键作用,电压依赖性钙通道与EGF的作用无关。
- 吴斌文王家何兴祥袁顺玉崔武任
- 关键词：人肝癌细胞株酪氨酸激酶电压依赖性钙通道
- 实时荧光定量PCR检测结直肠癌hPTTG1的表达及其意义被引量：4
- 2008年
- 背景与目的:虽然人垂体瘤转化基因1(human pituitary-tumor transforming gene1,hPTTG1)在结直肠癌等恶性肿瘤中高表达,然而hPTTG1 mRNA与结直肠癌临床病理参数之间的关系及其能否作为结直肠癌诊断和预后判断的分子标志尚不清楚。本研究检测hPTTG1 mRNA在结直肠癌中的表达,分析其与临床病理参数之间的关系,探讨hPTTG1 mRNA作为结直肠癌诊断和转移复发的分子标志的可能性。方法:采用实时荧光定量PCR检测结直肠癌组织与对应癌旁组织hPTTG1 mRNA,并分析其与临床病理指标的关系。结果:结直肠癌组织hPTTG1mRNA表达较正常癌旁组织显著增高(0.42±0.07vs.0.03±0.01,P<0.001)。hPTTG1 mRNA与肿瘤大小、血清CEA水平有关,肿瘤直径≥3.5cm较<3.5cm显著增高(15.80±8.80vs.10.91±5.22,P<0.05),血清CEA>5ng/mL较<5ng/mL显著增高(22.79±7.42vs.9.39±2.61,P<0.001)。hPTTG1mRNA在Dukes'C、D期显著高于Dukes'A、B期(15.88±8.09、25.69±7.67vs.9.03±0.35、9.58±2.93,P<0.001)。伴有淋巴转移、肝转移或其他器官转移者(17.63±8.47、31.07±4.10和22.78±6.39)较无转移者(11.15±6.65)显著增高(P<0.001)。hPTTG1 mRNA与患者的性别、年龄和病理分型无关(P>0.05)。结论:hPTTG1 mRNA在结直肠癌中高表达,与结直肠癌的疾病进展密切相关,有助于对患者病情进展的预测。
- 吴斌文马东李东风李友佳邓罡曾志刚张凯军张瑛华耿庆山
- 关键词：结直肠肿瘤实时荧光定量PCR
- hPTTG1在结直肠癌中的表达及其临床意义被引量：2
- 2008年
- 目的:检测人垂体瘤转化基因1(hPTTG1)在结直肠癌中的表达,分析其与临床病理参数之间的关系,为阐明hPTTG1在结直肠癌诊断和转移复发中的临床价值提供实验依据.方法:收集我院2004-01/2006-09结直肠癌及对应癌旁组织的手术标本60例.采用免疫组织化学和Western blotting检测结直肠癌组织与对应癌旁组织hPTTG1蛋白的表达,并探讨其与临床病理指标的关系.结果:60例结直肠癌组织有56例表达hPTTG1蛋白,阳性率为93.3%,而癌旁组织hPTTG1仅8例表达,且均为弱阳性,阳性率为13.3%(χ2=77.13,P<0.001).hPTTG1表达与血清CEA水平具有显著相关,血清CEA大于5mg/L较小于5mg/L显著增高(χ2=30.886,P<0.001).hPTTG1在DukesC、D期显著高于DukesA、B期(χ2=9.87,P<0.001).伴有淋巴转移、肝转移或其他器官转移者较无转移者显著增高(χ2=9.87,P<0.001).hPTTG1与患者的性别、年龄、肿瘤直径大小和病理分型无关.结论:hPTTG1在结直肠癌中高表达,与结肠癌的疾病进展密切相关,检测hPTTG1有助于患者预后的判断.
- 吴斌文马东李友佳李东风邓罡曾志刚张凯军张瑛华耿庆山
- 关键词：结直肠癌免疫组化
- 融合自杀基因FCU1对结肠癌细胞杀伤作用的实验研究
- 2007年
- 目的构建含融合自杀基因FCU1的重组质粒,经脂质体转染结肠癌细胞,同时给以前体药物5-FC,观察其对结肠癌细胞的杀伤作用。方法采用分子克隆技术,构建含融合自杀基因FCU1的真核表达质粒pEGFP-FCU1,经脂质体转染结肠癌细胞HCT116,采用MTT法检测前体药物5-FC对HCT116杀伤作用及其旁观者效应。结果重组质粒pEGFP-FCU1经酶切鉴定,与原始目的片段大小一致,测序与GenBank中序列一致,转染HCT116细胞后,可见荧光蛋白的表达,前体药物5-FC显示极强的杀伤作用和旁观者效应。结论FCU1/5-FC自杀基因系统,对结肠癌细胞具有显著的杀伤作用。
- 吴斌文张瑛华李东风李友佳徐丽姝邓罡曾志刚张凯军耿庆山
- 关键词：结肠癌融合自杀基因基因治疗
- miR-375对人结肠癌细胞株HCT116活性、细胞周期及凋亡的影响被引量：6
- 2015年
- 目的:探讨微小RNA-375(microRNA-375,miR-375)对人结肠癌细胞HCT116活性、细胞周期及凋亡的影响。方法:Real-time PCR检测不同结直肠癌细胞中miR-375的表达情况。脂质体转染法将miR-375模拟物(mimics)转入HCT116细胞,用real-time PCR法检测miR-375及AEG-1 mRNA的表达情况;MTT法检测细胞活性的改变情况;流式细胞技术检测miR-375对细胞凋亡及细胞周期的影响。结果:Real-time PCR结果显示HCT116在4个结直肠癌细胞株中miR-375的表达量最低;miR-375 mimics组中miR-375表达量较对照组明显上调;miR-375高表达可以显著抑制AEG-1 mRNA的表达水平。miR-375 mimics组细胞活性明显受到抑制,同时细胞凋亡率明显增加,G1期所占细胞数增加,而S期所占细胞数减少。结论:miR-375可以抑制结肠癌HCT116细胞的活性,介导细胞周期阻滞并促进其凋亡。miR-375作为一种抑癌因子,在结肠癌中可能通过抑制AEG-1发挥抑癌作用。
- 刘宝龙吴斌文黄素军李东风
- 关键词：结直肠癌细胞活性细胞周期
- 双功能融合基因在肝癌细胞中的表达与作用被引量：2
- 2004年
- 目的:构建含有融合基因FCU1的自杀基因系统,观察其对体外培养肝癌细胞的杀伤效应. 方法:将FCU1基因亚克隆于pEGFP-C1载体,转化大肠杆菌DH5α,阳性重组子转染肝癌细胞HepG2,绿色荧光蛋白检测FCU1的表达,用G418筛选出阳性细胞克隆后, 进行体外药物敏感实验,观察旁观者效应. 结果:FCUI基因正确插入到pEGFP-C1中,pEGFP-FCU1 转染成功的细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光,在5-FC作用下细胞的生长抑制率明显高于未转染细胞,且旁观者效应显著. 结论:本基因治疗体系具有很好的体外杀肿瘤效果,为肝癌的基因治疗提供了—个新的选择.
- 谢娜林菊生吴斌文黎培员
- 关键词：肝癌癌细胞
- 人角质化细胞生长因子2基因克隆、表达及其产物的纯化和鉴定(英文)被引量：2
- 2006年
- 背景:人角质化细胞生长因子2具有广泛的生理功能,在胚胎发育、组织的修复、神经的再生、血管的生成和肿瘤发展中具有重要作用。目的:克隆人角质化细胞生长因子2基因,于大肠杆菌中表达,并检测其生物学活性,为进一步开发提供实验依据。设计:开放性实验。单位:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。材料:实验于2000-09/2002-05在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室完成。pBV220温控表达载体为病毒基因工程国家重点实验室构建,EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA连接酶(Promega公司);人角质化细胞生长因子2特异性聚合酶链反应引物(上海博亚生物技术有限公司合成);肝素-SepharoseCL-6B(Pharmacia公司);快速聚合酶链反应产物纯化试剂盒、总RNA提取Trizol试剂盒、反转录-聚合酶链反应试剂盒(GIBCO公司);质粒DNA快速提取试剂盒(博大公司);BL-21-codonpluscompentcells(Stratagene公司)。方法:用高表达菌株BL-21-codonpluscompententcells表达重组人角质化细胞生长因子2蛋白并初步纯化和检测其活性。通过反转录-聚合酶链反应从自然流产胎儿肺组织中钓取人角质化细胞生长因子2cDNA,将其克隆入pBV220载体质粒。在大肠杆菌BL-21-codonpluscompentcells中表达人角质化细胞生长因子2蛋白。采用亲和层析和离子交换层析分离纯化,以细胞增殖实验测定表达蛋白的生物活性。主要观察指标:人角质化细胞生长因子2cDNA的片段长度和序列,人角质化细胞生长因子2基因在大肠杆菌中的表达,纯化人角质化细胞生长因子2的活性。结果:人角质化细胞生长因子2cDNA片段大小约500bp,人角质化细胞生长因子2蛋白在BL-21中得到高效表达,于上清中可溶性表达,SDS-PAGE显示相对分子质量约20000;人角质化细胞生长因子2蛋白对NIH3T3细胞具有显著的促有丝分裂活性,1,5,10μg/L人角质化细胞生长因子2A值(
- 吴斌文段招军李武平陈勇吕宏亮衣作安张成海林菊生王家侯云德
- 关键词：角蛋白细胞基因表达
