王楠 作品数:32 被引量:71 H指数:5 供职机构: 广州市胸科医院 更多>> 发文基金: 广州市科技计划项目 广东省自然科学基金 广东省医学科学技术研究基金 更多>> 相关领域: 医药卫生 更多>>
稀释剂种类和冻融次数对质粒标准品实时荧光定量PCR检测的影响 被引量:2 2019年 目的探讨稀释剂种类和冻融次数这两种因素对实时荧光定量PCR检测中质粒标准品的影响。方法 分别采用ddH2O和TE缓冲液两种稀释剂将质粒标准品稀释为1×10^8、1×10^7、1×10^6、1×10^5、1×10^4拷贝/μl的5个浓度检测液各5份,在冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次之后进行实时荧光定量PCR检测,比较其Ct值。结果 ①浓度1×10^8、1×10^7、1×10^6、1×10^5、1×10^4拷贝/μl时,冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次之后,质粒标准品在ddH2O和TE缓冲液两种稀释剂中,实时荧光定量PCR检测Ct值中位数分别为17.46和17.32(P>0.05),23.52和23.61(P>0.05),26.77和26.37(P>0.05),32.73和30.88(P<0.05),33.08和31.51(P<0.05)。②冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次,在ddH2O和TE缓冲液中,各浓度标准品Ct值中位数分别如下:1×108拷贝/μl:17.43、17.56、17.45、17.45、17.26、17.94(P>0.05)和17.38、17.36、17.47、17.31、17.30、17.62(P>0.05);1×10^7拷贝/μl:22.17、23.16、24.12、23.51、23.94、23.89(P<0.05)和22.40、24.09、24.07、23.54、23.68、24.05(P<0.05);1×10^6拷贝/μl:24.66、25.27、26.66、27.29、27.78、27.40(P<0.05)和24.92、26.22、26.31、26.59、26.93、26.53(P<0.05);1×10^5拷贝/μl:29.25、30.66、32.72、32.84、33.27、33.39(P<0.05)和29.21、30.10、30.97、30.87、31.72、32.44(P<0.05);1×10^4拷贝/μl:31.05、30.50、32.99、33.21、33.59、33.41(P<0.05)和31.22、31.28、31.49、31.52、32.37、32.31(P<0.05)。结论 相对于ddH2O,质粒标准品选择用TE缓冲液作为稀释剂更稳定。质粒标准品随着冻融次数增多,其稳定性越差,因此要避免反复冻融质粒标准品。 雷杰 牛群 王楠 杨瑜 谢贝 刘志辉 孟繁荣关键词:冻融 稀释剂 实时荧光定量PCR 吡嗪酰胺耐药的耐多药结核分枝杆菌pncA基因表达分析 被引量:1 2023年 目的 比较吡嗪酰胺(PZA)耐药的耐多药结核分枝杆菌在PZA药物刺激前后PZA耐药基因pncA的表达,探讨pncA基因表达与结核分枝杆菌PZA耐药的关系。方法 培养PZA耐药的耐多药结核分枝杆菌,检测其利福平和PZA最小抑菌浓度(MIC);以PZA浓度为0和50μg/mL的培养基培养菌株,实时荧光定量PCR检测菌株pncA的表达水平。结果 21株结核分枝杆菌PZA的MIC≥1 600μg/mL、12株为400~800μg/mL、5株为100~200μg/mL;分别定义相应PZA耐药水平为高、中、低,其利福平的MIC中位数分别为128、128、64μg/mL,任意2组利福平的MIC比较差异均无统计学意义(P均> 0.05);以相对定量2^(-ΔΔCt)法计算PZA高、中、低水平耐药结核分枝杆菌pncA表达水平,无药组分别为0.904(0.202,2.653)、1.157(0.658,1.511)、1.147(0.372,1.347),PZA浓度为50μg/mL处理组分别为1.544(0.611,3.191)、0.846(0.421,1.237)、0.726(0.225,3.017);以无药组为对照,PZA含药培养组与其对比,pncA基因表达差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 PZA耐药的耐多药结核分枝杆菌在PZA药物刺激前后pncA表达无明显变化。 王楠 杨瑜 邓丽 吴玲 刘志辉 孟繁荣关键词:结核分枝杆菌 耐药 吡嗪酰胺 利福平 PNCA 结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变与其他抗结核药物耐药的相关性 被引量:3 2023年 目的探讨不同抗结核药物对结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因突变的影响,以进一步准确理解结核分枝杆菌异烟肼耐药的分子机制。方法在广州地区分枝杆菌菌株库中选择异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、阿米卡星、克拉霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福布丁、丙硫异烟胺和对氨基水杨酸等11种抗结核药物的药敏性试验临床测定结果明确的结核分枝杆菌分离株进行katG、mabA-inhA、oxy RahpC、kasA和ndh基因测序,以结核分枝杆菌H37Rv标准序列为参照进行基因突变分析,应用卡方检验对比分析H^(-)(R/F/O)^(-)与H^(-)(R/F/O)^(+)、H^(+)R-与H^(+)R^(+)、H^(+)F^(-)与H^(+)F^(+)和H^(+)O^(-)与H^(+)O^(+)几大菌群之间5种基因突变发生总频率的差异(其中R、H、F、O分别代表利福平、异烟肼、左氧氟沙星与莫西沙星2种氟喹诺酮类药物和其他7种药物,“+”表示耐药、“-”表示敏感)。结果在143株异烟肼敏感结核分枝杆菌株中,H^(-)(R/F/O)-耐药表型株中5种异烟肼耐药相关基因的突变总频率为11.32%(12/106),在37株H^(-)(R/F/O)+耐药表型株中则为40.54%(15/37),两者间差异有统计学意义(χ^(2)=15.289,P<0.001);在224株异烟肼耐药结核分枝杆菌株中,H^(+)R-、H^(+)R^(+)、H^(+)F^(-)、H^(+)F^(+)、H^(+)O^(-)和H^(+)O^(+)六大菌群的突变总频率分别是47.87%(45/94)、93.85%(122/130)、68.64%(116/169)、89.09%(49/55)、55.56%(15/27)和77.16%(152/197),H^(+)R-与H^(+)R^(+)、H^(+)F^(-)与H^(+)F^(+)和H^(+)O^(-)与H^(+)O^(+)之间基因突变总频率差异有统计学意义(χ^(2)=60.778、11.99、5.841,P<0.001、0.001和0.016)。结论结核分枝杆菌INH耐药相关基因突变虽然取决于对INH的敏感性,但是否同时对其他抗结核药物耐药也可产生重要影响,值得人们深入研究。 龚兰 牛群 王楠 王楠 吴玲 雷杰 谢贝 吴玲 李华 杨瑜 谢贝 孟繁荣关键词:结核分枝杆菌 异烟肼 基因突变 广东地区结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因变异特征 被引量:4 2022年 目的探讨广东地区不同耐药表型的结核分枝杆菌临床分离株利福平耐药基因rpoB变异特征,为更精准快速分子检测技术的研发提供依据。方法从分枝杆菌菌种保藏库中筛选利福平(R)、异烟肼(H)、乙胺丁醇(E)、链霉素(s)敏感性明确的结核分枝杆菌临床分离株373株。对373株临床分离株采用聚合酶链式反应技术扩增包含利福平耐药决定区(RRDR)在内的rpoB基因片段并进行序列测定与分析。结果(1)373株菌株样本中,192株检测到rpoB基因变异,共发生225个突变包括碱基置换、插入、缺失在内的40种突变种类,531、526、511、516、533、515位点突变最为常见,占比分别为43.11%(97/225)、20.89%(47/225)、10.22%(23/225)、8%(18/225)、4.44%(10/225)、4%(9/225);(2)192例rpoB突变株中,159株仅发生单位点突变,33株发生双位点突变,其中D516V、H526L、H526D、H526R、S531W等14种突变种类只在单位点突变中出现,为单位点特有变异,M515T、H526Q、D516G、M515V、E541A等21种突变种类只在双位点突变中出现,为双位点特有变异,S531L、L511P、H526Y等5个种类突变为单双位点共有变异,不存在3个位点的同时变异。(3)对4个一线药物全敏感菌株(Q)、R敏感H耐药株(RSHR)、R耐药H敏感株(RRHS)和耐HR株(MDR)的rpoB基因突变率分别为4.67%(5/107)、28.42%(27/95)、90.62(29/32)、94.24%(131/139),除RRHS与MDR株间突变率不具统计学差异外(P>0.05),Q/R^(S)H^(R)、Q/R^(R)H^(S)、Q/MDR、R^(S)H^(R)/R^(R)H^(S)、R^(S)H^(R)/MDR间rpoB基因突变率具有统计学差异(均P<0.001)。结论广东地区结核分枝杆菌rpoB基因突变具有多样性、地域性特点,不同耐药表型可能对rpoB基因突变产生深远影响。 孟繁荣 雷杰 牛群 王楠 吴玲 杨瑜 谢贝 李华 高俊文 傅红梅 刘志辉关键词:结核分枝杆菌 RPOB基因 基因突变 一种细胞因子组及其应用 本发明公开了一种细胞因子组及其应用,细胞因子组包括IFN‑γ、IL‑17和IFN‑α细胞因子;细胞因子组的应用为将细胞因子组用于检测中,例如将细胞因子的浓度数据用于非疾病诊断的检测中,获得每一项细胞因子在待测样本经干涉后... 李华 王琪 刘志辉 张言斌 许婉华 龚兰 谢贝 杨瑜 吴玲 孟繁荣 王楠402例广州市耐多药结核病患者人口学特征分析 2017年 目的通过耐多药结核病患者人口特征分析,初步探索本市耐用多药结核病流行规律。方法依托本院广东地区结核病生物样本库信息资料系统,对2009—2015年来就诊且相关资料齐备的402例耐多药结核病患者进行回顾性分析,从患者性别构成、户籍类别、居住地域分布、年龄结构等方面探讨其人口学特点。结果在402例耐多药结核患者中,男、女性别比为2.12。其中:广州市户籍人口患者占56.96%(229/402)、广东省内流动人口患者占15.92%(64/402)、广东省外流动人口患者占27.11%(109/402);中心城区人口和城市郊区人口患者分别占56.72%(228/402)和43.28%(174/402);少年(<15岁)、青年(15~44岁)、中年(45~64岁)、老年(≥65岁)年龄别患者分别占0.25%(1/402)、57.96%(233/402)、30.85%(124/402)、10.95%(44/402)。结论广州市耐多药结核病流行具有以中青年为主、在人口稠密的城市中心区居住与流动人口所占例大等人口学特点,预示其控制难度大,必须高度关注并采取强力措施以遏制耐多药结核病的蔓延。 吴玲 刘志辉 雷杰 王楠 牛群 谭守勇 邝浩斌关键词:结核 耐多药 人口学特征 中国氟喹诺酮耐药结核分枝杆菌gyr基因序列特征分析 被引量:4 2020年 目的明晰我国氟喹诺酮类药物耐药结核分枝杆菌株gyrA、gyrB基因突变的分子特征。方法以检索式"quinolones resistance AND Mycobacterium tuberculosis AND(China OR Hong Kong OR Tai Wan OR Macon)"和"结核AND喹诺酮耐药"分别在英文数据库(pubmed、Embase、SciFinder)和中文数据库(万方、中国知网、中国生物医学文献服务系统与维普期刊资源服务平台)中检索有关我国结核分枝杆菌喹诺酮类药物耐药基因突变的研究文献,对符合纳入标准的文献中氟喹诺酮耐药基因gyrA、gyrB进行突变位点和氨基酸变化类型等计数资料的信息提取和分析。结果 32篇外文和23篇中文文献纳入研究,3 641株氟喹诺酮类耐药结核分枝杆菌的gyrA基因得到分析,其中1 958株同时分析了gyrB基因。3 641株耐药菌中,2 830株检测到gyrA基因突变(突变率为77.73%),共47种突变类型,均为氨基酸错义突变,其中单位点、双位点突变的发生率分别为75.83%和1.92%,94、90、91位密码子突变率分别为49.33%(1 796/3 641)、19.14%(697/3 641)、5.80%(211/3 641),出现频率最高的突变类型依次为Asp94Gly、Ala90Val、Asp94Ala、Asp94Asn、Ser91Pro、Asp94Try;1 958株耐药菌中,175株发生gyrB基因突变(突变率为8.94%),其中56株的29个突变类型为gyrB单基因突变,其余119株36种突变类型与gyrA基因突变共同发生,占gyrB序列突变的68%。结论我国结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药株gyrA基因突变以94、90、91位密码子单位点突变为主;gyrB基因突变位点较为分散,常与gyrA基因突变伴随发生。 孟繁荣 杨瑜 雷杰 王楠 李华 谢贝 邓丽 牛群 竺澎波 高俊文 刘志辉关键词:结核分枝杆菌 氟喹诺酮耐药 GYRA GYRB 血清中相关细胞因子表达水平变化对肺结核治疗效果的评估 被引量:8 2022年 目的分析血清中相关细胞因子表达水平变化在肺结核治疗效果评估中的检验效能。方法分别收集肺结核患者治疗前和治疗2月时血清,通过流式细胞术测量其中白细胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12P70、IL-17、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ和IFN-α的表达水平。同时影像学监测病灶变化情况,较治疗前,治疗2月时病灶无变化及增大为无效组,病灶吸收为有效组。受试者工作曲线分析血清中各细胞因子治疗2月与治疗前浓度的比值(Ratio值)区分肺结核治疗无效和有效的界值和检验效能。进一步将不同细胞因子串联或并联后,分析其组合后的检验效能。结果(1)无效组和有效组患者的年龄和性别差异无统计学意义。总体而言,肺结核患者治疗两月后血清中IL-6、IFN-γ表达水平较治疗前降低,差异具有统计学意义(P=0.020、0.023),IL-10表达水平较治疗前升高,差异具有统计学意义(P=0.011)。有效组治疗两月后肺结核患者血清中IL-6表达水平较治疗前降低,差异具有统计学意义(P=0.033)。(2)TNF、IL-17、IL-1β、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-12P70、IFN-α和IL-8的Ratio值在判断肺结核治疗无效时的敏感度>80%,但特异度较低;IL-5和IL-10的Ratio值在判断肺结核治疗无效时的特异度>80%,但敏感度较低。(3)IFN-γ、IL-17和IFN-α三种细胞因子串联组合后,在判断肺结核治疗无效时的灵敏度84.00%,特异度70.97%,准确度76.79%;IL-6和IFN-α两种细胞因子串联组合后,在判断肺结核治疗无效时的灵敏度80.00%,特异度67.74%,准确度73.21%。结论对比治疗前,肺结核患者治疗2月后血清中部分细胞因子表达水平的变化有用于抗结核治疗效果监测的潜力。 李华 许婉华 龚兰 谢贝 杨瑜 刘志辉 吴玲 孟繁荣 王楠 王琪 张言斌关键词:肺结核 细胞因子 4种蛋白质/多肽在结核病患者与健康人血清中的表达和意义 2014年 目的:评价质荷比(m/z)分别为1 060、1 944、2 081和3 954的4种血清蛋白质/多肽(以下分别用A、B、C和D表示)区分结核病患者与健康人的能力。方法:应用表面增强激光解析-电离飞行时间质谱技术检测57例结核病患者和30例健康人的血清蛋白质谱,分析其A、B、C、D中的表达水平(用相对强度表示)并比较其差异,并应用诊断性试验评价方法分析其区分结核病患者群与健康人群的能力。结果:(1)A、B、C、D在结核病患者和健康人中的表达水平分别为1±11、1 597±3 102、460±765、1 208±1 003和123±201、47±98、36±93、397±355,两者差异显著。(2)以A、B、C、D血清表达水平为指标判定结核病患者和健康人的ROC曲线下面积分别为0.644、0.848、0.735和0.810,分界值分别为≤166、≥318、≥48和≥728。结论:B、C和D 3种血清蛋白质/多肽具有较好的区分结核病患者与健康人的能力,有望作为新型结核病诊断候选标志物。 刘志辉 刘玉美 孟繁荣 谢贝 王楠 邓晓华 吴玲 张言斌 谭守勇关键词:结核病 以居住地域为基础的广州地区结核病传播链分子流行病学初探 被引量:1 2020年 目的探讨MIRU-VNTR基因分型技术用于分析广州地区结核病传播关系的可行性。方法以结核患者居住地所属乡镇村组或社区街道相同为前提,假定居住所属地相同结核患者间存在传播关系,拟定广州地区结核病传播链。培养结核分枝杆菌临床分离株并提取DNA,通过PCR扩增进行29位点MIRU-VNTR基因分型分析,并计算HGDI分辨力指数。以基因型成簇与否评价传播链内结核患者间传播关系的有无。结果拟定了178条广州地区结核病传播链,复苏得到456株结核分枝杆菌临床分离株,提取获得其基因组DNA并扩增了29个VNTR位点,其组合HGDI分辨力指数为0.986。基因成簇性分析显示,有2条传播链内患者结核分枝杆菌临床分离株基因成簇,成簇率为1.10%。基因成簇性的2条传播链患者分别居住于同街道,发病时间间隔在2年以内,分别为9和14个月。结论29位点MIRU-VNTR基因分型技术可用于广州地区结核分枝杆菌基因型分析,能否用于结核病传播关系需要进一步深入研究。 竺澎波 王楠 孟繁荣 杨瑜 雷杰 牛群 谢贝 吴玲 李华 刘志辉 刘文关键词:结核 结核分枝杆菌 传播链