单云波
- 作品数：17 被引量：45H指数：5
- 供职机构：苏州大学医学部细胞与分子生物学教研室更多>>
- 发文基金：江苏省高校自然科学研究项目国防科技工业技术基础科研项目国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学轻工技术与工程化学工程更多>>
- Ang-1和VEGF165腺病毒的载体构建及其表达
- 目的:构建人血管生成素-1(Ang-1)和人血管内皮生长因子VEGF165(VEGF165)的腺病毒载体,为下一步用Ang-1和VEGF165转基因细胞修饰丝素材料进行动物创伤恢复实验研究奠定基础。
方法:通过...
- 刘铁连谢宇锋盛伟华缪竞成单云波胡志清井莹莹杨吉成
- 关键词：血管生成素-1腺病毒载体RT-PCR法血管形成
- 文献传递
- 腺病毒介导的ING4对裸鼠人骨肉瘤移植瘤的生长抑制作用被引量：2
- 2009年
- 目的:研究腺病毒介导的人ING4基因(Ad-ING4)对MG-63人骨肉瘤细胞移植瘤的生长抑制作用及其机制。方法:将本室构建好的重组腺病毒表达载体Ad-ING4,经QBI-293A细胞感染多轮扩增后获得高效价重组病毒子以用于肿瘤基因治疗试验,首先建立MG-63人骨肉瘤细胞移植瘤裸鼠模型,然后将15只荷瘤裸鼠随机分为阴性对照组(PBS组)、空载体对照组(Ad-GFP组)、Ad-ING4实验组(Ad-ING4组),3组均使用瘤体内注射干预用药,隔日一次,共5次。分别于用药前和用药后测量皮下瘤的体积,治疗开始后的第15天将裸鼠脱颈处死,摘取瘤体称重,计算抑瘤率。HE染色观察移植瘤细胞形态,免疫组化法检测瘤体中Bcl-2、Bax、Caspase-3、VEGF、CD34细胞因子的表达。结果:获得了高滴度(109pfu/ml)的重组腺病毒Ad-ING4;经瘤体基因治疗后,Ad-ING4组与PBS组及Ad-GFP组相比,可以明显抑制裸鼠MG-63人骨肉瘤细胞移植瘤生长,瘤重抑制率可达59.3%,移植瘤组织中可出现典型的细胞凋亡、坏死现象,其分子机制可能与Ad-ING4明显上调瘤体中促进凋亡的细胞因子Bax、Caspase-3的表达,下调抑制凋亡因子Bcl-2及血管形成细胞因子VEGF、CD34的表达有关。结论:Ad-ING4可以显著抑制MG-63人骨肉瘤细胞荷瘤生长,其机制可能通过激活细胞凋亡和抑制血管形成等途径来发挥抑瘤作用。
- 韩亚丽缪竞诚盛伟华井莹莹单云波刘铁连李正祎包婉蓉杨吉成
- 关键词：ING4腺病毒抑瘤
- 逆转录病毒载体介导的hLIF基因真核稳定表达体系的建立
- 2008年
- 目的构建逆转录病毒载体介导的人白血病抑制因子(human leukemia inhibitory factor,hLIF)基因真核稳定表达细胞株。方法采用DNA重组技术,构建并鉴定重组逆转录病毒载体pEGZ/MCS-HA-hLIF;以脂质体转染法,将重组逆转录病毒载体与辅助质粒HIT456、HIT60共转染入包装细胞系293T包装逆转录病毒,感染人胚肾成纤维细胞系,经zeocin筛选获得真核稳定表达细胞株;采用RT-PCR法和ELISA法鉴定hLIF基因的转录和翻译,并检测表达上清中hLIF因子对人白血病细胞HL-60的生物学活性。结果PCR产物电泳后于609 bp处见特异性条带。双酶切出现两条带,其中位于609 bp处可见相应条带。核酸测序结果与GenBank中所报道的hLIF基因的CDS序列完全一致。RT-PCR结果显示表达细胞中存在hLIF基因转录,ELISA结果测定表达上清中hLIF的浓度为110.134 pg/ml。结论携带hLIF基因的重组逆转录病毒载体pEGZ/MCS-HA-hLIF构建成功,并且获得了稳定表达hLIF基因的人胚肾成纤维细胞株,这为此基因的临床应用和实验研究打下了基础。
- 苗莉郁心谢宇锋盛伟华杨吉成刘铁连单云波井莹莹胡志清缪竞诚
- 关键词：逆转录病毒载体基因重组真核表达
- CD34^+造血干/祖细胞在转hLIF基因腺病毒载体饲养层细胞中的扩增及其移植SCID小鼠的实验研究被引量：1
- 2009年
- 目的:建立转hLIF基因腺病毒载体的饲养层细胞,观察对CD34+造血干/祖细胞的扩增作用,并研究移植辐射损伤模型SCID小鼠的效果。方法:建立转hLIF基因腺病毒载体的饲养层细胞,并用RT-PCR法鉴定目的基因;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术检测纯度;将CD34+造血干/祖细胞与饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果,建立辐射损伤模型SCID小鼠,将扩增后的CD34+造血干/祖细胞经CFDASE荧光标记后移植入SCID小鼠体内,通过RT-PCR和观察荧光标记细胞来检测小鼠内的人源细胞。结果:建立的转基因饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR法证实有目的基因表达,免疫磁珠法分离的CD34+造血干/祖细胞纯度可达(95.6±2.58)%,与饲养层细胞共培养后CD34+造血干/祖细胞可扩增13.2倍,表面粘附分子CXCR4和CD54表达量仍较高,移植入SCID小鼠四周后,仍可见带有荧光标记的人源细胞,RT-PCR证明人源基因Alu的存在。结论:建立的转hLIF基因腺病毒载体饲养层细胞可以有效地扩增CD34+造血干/祖细胞,延缓其分化,并且有较高的移植效率和造血活性。
- 井莹莹杨吉成缪竞诚盛伟华胡志清郁心单云波刘铁连韩亚丽包婉蓉张日朱南康
- 关键词：腺病毒载体SCID小鼠
- Ad-LIF-IL-24共表达腺病毒载体对胶质瘤细胞的抑癌增效和分子机制的研究
- 目的:构建LIF和IL-24双基因共表达腺病毒载体/(Ad-LIF-IL-24/),研究其对胶质瘤细胞的抑癌增效和分子机制。
方法:分别以pORF-mbcl-2α质粒为模板,PCR分别扩增出polyA和pro...
- 单云波
- 关键词：LIFIL-24腺病毒胶质瘤
- 文献传递
- Ad—hLIF转基因饲养层细胞对CD34^＋造血干／祖细胞增殖和分化的影响
- 2009年
- 目的用腺病毒载体介导的人白血病抑制因子基因（Ad—hLIF）感染WT-38人胚肺成纤维细胞制备饲养层细胞，体外观察转基因细胞对CD34^＋造血干／祖细胞增殖和分化的影响，体内研究对辐射损伤SCID小鼠造血功能恢复的效果。方法用RT—PCR和ELISA法鉴定Ad—hLIF转基因饲养层细胞目的基因的表达后，将经免疫磁珠法分离和流式细胞术检测后的CD34^＋细胞在饲养层和／或细胞因子培养体系中扩增28d，检测不同时问点的单个核细胞（MNC）数量及CD34^＋细胞阳性率；扩增后的MNC经CFDASE荧光标记后移植入辐射损伤SCID小鼠体内，RT—PCR和细胞荧光标记法检测小鼠内含Alu基因人源细胞的归巢情况。结果感染50MOI（multiplicityofinfection）Ad·hLIF的饲养层细胞均有绿色荧光，RT—PCR和ELISA法结果显示hLIF日的基因能在WI-38饲养层细胞中表达，免疫磁珠法分离的CD34^＋造血干／祖细胞经流式细胞术检测其纯度可达95．60％±2．58％，MNC在Ad-hLIF转基因饲养层培养体系持续扩增，最高可达356．95±0．87倍，其中CD34^＋细胞仅在0～14d能维持较高水平，最高可扩增52．11±1．13倍，以后逐渐降低。将其移植辐射损伤SCID小鼠后，可明显提高小鼠存活率，4周内小鼠骨髓中不仪可观察到CFDASE荧光标记的细胞，而凡经RT．PCR法鉴定后，还可检测到表达Alu人源基因的人脐血造血归巢细胞。结论成功建立的Ad—hLIF转基因饲养层细胞不仅体外可以有效地扩增CD34^＋造血干／祖细胞，并延缓其分化。扩增的CD34^＋细胞对辐射损伤SCID小鼠具有造血功能恢复的功能。
- 井莹莹杨吉成盛伟华胡志清郁心单云波刘铁连韩亚丽包婉蓉张日朱南康缪竞诚
- 关键词：腺病毒载体SCID小鼠
- Ad-ING4-poly（A）-Promoter-IL-24双基因共表达载体构建及表达
- 2010年
- 目的 构建poly（A）-Promoter介导的携带人肿瘤生长抑制因子4（ING4）和人白细胞介素-24（IL-24）双基因的重组腺病毒共表达载体Ad-ING4-poly（A）-Promoter-IL-24（简称Ad-ING4-IL-24）,研究Ad-ING4-IL-24对HepG-2人肝癌细胞生长的影响.方法 以含有poly（A）和Promoter （hEF1-eIF4g）基因片段的pORF-mbcl-2α质粒为模板,PCR扩增poly（A）-Promoter目的 片段（含Sal Ⅰ,Not Ⅰ）,亚克隆至pAdTrack-CMV载体中以构建pAdTrack-CMV-poly（A）-Promoter空载体,再分别以pcDNA3.0-ING4和pcDNA3.0-IL-24重组质粒为模板,PCR扩增ING4（含BglⅡ,Sal Ⅰ）和IL-24（含XhoⅠ,XbaⅠ）目的 基因片段,并依次插入pAdTrack-CMV-poly（A）-Promoter载体中构建pAdTrackCMV-ING4-Poly（A）-Promoter-IL-24双基因共表达重组转移载体,测序正确后用Pme Ⅰ酶线性化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1构建同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-poly（A）-Promoter-IL-24,再经Pac Ⅰ酶线性化后用脂质体转染QBI-293A包装细胞,经多轮扩增后收获Ad-ING4-IL-24重组腺病毒子,其效价可达3.5×109PFU/ml,用RT-PCR和Western blot法分别鉴定ING,4和IL-24基因在HepG-2人肝癌细胞中的转录和表达,MTT法和流式细胞仪检测Ad-ING4-IL-24对HepG-2人肝癌细胞生长抑制和诱导细胞凋亡的功能及其增效作用.结果 DNA测序结果显示pAdTrack-CMV转移载体中插入的ING4、poly（A）-Promoter和IL-24序列与GenBank报道的完全一致,RT-PCR和Western blot检测结果显示Ad-ING4-IL-24能成功介导ING4和IL-24基因在HepG-2人肝癌细胞中表达 并能明显抑制HepG-2人肝癌细胞的生长和诱导其凋亡,其中Ad-ING4-IL-24双基因组更优于相应各单基因组.结论 成功构建了poly（A）-Promoter介导的Ad-ING4-IL-24双基因共表达重组腺病毒载体,Ad-ING4-IL-24不仅能明显抑制HepG-2人肝癌细胞生长和诱导其凋亡,而且与Ad-ING4和AdIL-24单基因组相比具有抑癌增效作用.
- 盛伟华谢宇锋缪竞诚顾范博单云波刘铁连井莹莹胡志清杨吉成
- 关键词：生长抑制因子4IL-24肿瘤基因治疗
- Ad-IL-24对MG-63人骨肉瘤细胞抑癌效应的体内外实验被引量：3
- 2009年
- 本研究旨在分析腺病毒携带的IL-24基因在体内外对人骨肉瘤细胞生长抑制效应及其分子机制。将Ad-IL-24重组腺病毒感染MG-63细胞,用荧光显微镜、RT-PCR法检测IL-24在MG-63细胞中的转录和表达;MTT法、流式细胞技术和Hoechst染色法检测IL-24基因的表达对MG-63细胞的生长抑制和凋亡效应;半定量RT-PCR法检测IL-24基因的表达对MG-63细胞中的bcl-2、bax、caspase-3相关基因表达的影响。用Ad-IL-24重组腺病毒在MG-63骨肉瘤荷瘤裸鼠的瘤体内进行注射治疗,观察肿瘤生长变化,15d后处死裸鼠,摘除瘤体,称瘤重。并通过免疫组化法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3等与细胞凋亡相关因子的表达。结果表明Ad-IL-24重组腺病毒感染MG-63细胞后,能明显抑制MG-63细胞增殖,并能通过上调细胞中bax、caspase-3和下调bcl-2基因表达,诱导细胞凋亡,呈现出典型细胞凋亡形态学变化。Ad-IL-24重组腺病毒瘤内注射MG-63裸鼠荷瘤骨肉瘤移植瘤后,能显著抑制肿瘤生长,瘤重的抑制率可达52%,免疫组化结果显示Ad-IL-24重组腺病毒能明显上调与细胞凋亡相关因子Bax和Caspase-3的表达和下调Bcl-2和CD34的表达。本研究结果显示腺病毒介导的IL-24基因在体内外均可明显抑制MG-63人骨肉瘤细胞的生长,诱导其凋亡,其机制可能与下调bcl-2,上调bax、caspase-3的基因表达水平有关,由此为骨肉瘤的基因治疗提供实验依据。
- 韩亚丽缪竞诚盛伟华汪小华井莹莹单云波刘铁连包婉蓉杨吉成
- 关键词：IL-24基因腺病毒载体肿瘤抑制
- Ad-IL-24对SGC-7901胃癌细胞生长抑制的体外实验被引量：9
- 2009年
- 旨在研究携带人IL-24基因的腺病毒表达载体(Ad-IL-24)对SGC-7901人胃癌细胞的生长抑制作用并分析其分子机制。以不同MOI(感染复数)的Ad空载体腺病毒感染SGC-7901人胃癌细胞,筛选出最佳感染剂量;Ad-IL-24以最佳感染剂量感染SGC-7901胃癌细胞,RT-PCR法和Western blotting法检测腺病毒介导的IL-24基因在SGC-7901胃癌细胞中的转录;MTT法检测Ad-IL-24对SGC-7901胃癌细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测其诱导SGC-7901人胃癌细胞凋亡和细胞周期改变的效应,Hoechst33258染色荧光显微镜检测其诱导胃癌细胞凋亡的核形态改变;RT-PCR半定量法进一步检测SGC-7901胃癌细胞中凋亡相关基因的转录。结果显示,100MOI为感染SGC-7901胃癌细胞的腺病毒最佳感染剂量;Ad-IL-24能成功介导IL-24基因在SGC-7901胃癌细胞中转录性表达;Ad-IL-24感染SGC-7901胃癌细胞后,能明显抑制胃癌细胞生长和诱导凋亡;Ad-IL-24能显著上调SGC-7901胃癌细胞中bax、caspase-3和p53的表达和下调bcl-2的表达。因此,腺病毒介导的IL-24表达具有明显抑制SGC-7901人胃癌细胞生长和诱导凋亡的抗肿瘤效应,其机制可能与上调bax/bcl-2、caspase-3和p53密切相关。
- 包婉蓉缪竞诚盛伟华单云波李正祎汪小华井莹莹韩亚丽杨吉成
- 关键词：腺病毒胃癌肿瘤基因治疗抗肿瘤效应
- 腺病毒载体介导的ING4基因对MG-63人骨肉瘤细胞的抑制作用被引量：9
- 2009年
- 目的:用人源化改造的鼠肿瘤生长抑制因子(mING4)基因构建的腺病毒表达载体(Ad-ING4)研究对MG-63人骨肉瘤细胞的抑制作用。方法:以pcDNA3.0-mING-4重组质粒为模板,通过基因定点突变技术对mING4基因进行人源化改造,采用腺病毒载体的基因重组和体外包装技术获得表达与人ING-4氨基酸序列相同的重组腺病毒子(Ad-ING4),感染MG-63细胞,用荧光显微镜、RT-PCR法检测ING4在MG-63细胞中的转录和表达;MTT法和流式细胞技术检测ING4基因表达对MG-63细胞的生长抑制和凋亡效应;荧光共聚焦显微镜观察MG-63细胞凋亡的形态学变化;半定量RT-PCR法检测ING4基因表达对MG-63细胞中的Bax、Bcl-2基因表达的影响。结果:基因测序和PCR分析结果显示,人源化改造的小鼠ING4分子氨基酸序列与人ING4分子完全相同,成功构建了Ad-ING4腺病毒表达载体,在MG-63细胞中ING4基因的表达对MG-63细胞增殖有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡,出现典型细胞凋亡形态学变化,ING4基因表达可通过上调细胞中Bax和下调Bcl-2基因表达诱导细胞凋亡。结论:转染ING4基因可明显抑制MG-63人骨肉瘤细胞的生长,诱导细胞凋亡,该现象可能是通过改变Bax,Bcl-2表达水平来发挥抗肿瘤作用的。
- 井莹莹杨吉成缪竞诚盛伟华胡志清单云波刘铁连韩亚丽包婉蓉
- 关键词：ING4基因腺病毒载体凋亡
