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包装信号可以被Cre重组酶切除的辅助性腺病毒的构建及鉴定: 2010年; 目的:为了探索构建第三代复制依赖性腺病毒载体系统的有效实验方法,利用细菌内重组原理,分别构建了第三代腺病毒生产体系中的辅助性腺病毒和表达Cre重组酶的真核表达载体,并分析了Cre切除辅助病毒包装信号的有效性。方法:通过PCR及酶处理法依次将2个同向的loxP位点及绿色荧光蛋白表达盒克隆至pShuttle穿梭载体质粒,按照AdEasy系统的标准实验方法产生和扩增辅助病毒;同时构建pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体,并用该载体经脂质体法转染HEK293细胞,通过PCR和流式细胞术分析转染细胞内表达的Cre重组酶对随后感染的辅助病毒的包装信号的切除作用。结果:构建的辅助性腺病毒能够在HEK293细胞内扩增,其包装信号可以由细胞内表达的Cre重组酶有效切除。结论:构建了辅助性腺病毒和pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体,为第三代腺病毒的生产奠定了实验基础。; 董刚俞卫锋徐学武吴飞翔袁扬; 关键词：CRE重组酶

含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒载体的构建与鉴定被引量：3: 2005年; 目的:构建含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒。方法:构建腺病毒穿梭质粒pDC312-DTREE,与骨架质粒共转染HEK293细胞,细胞内同源重组包装出腺病毒腺相关杂合病毒。PCR法鉴定病毒及TCID50法测定病毒滴度。杂合病毒感染NIH3T3细胞观察转基因的表达,ELISA法测定表达产物浓度。结果:穿梭质粒pDC312-DTREE经限制性核酸内切酶AatII及NotI酶切结果正确。PCR鉴定结果表明病毒DNA内有人β-内啡呔DNA序列,且无野生型病毒的污染,病毒滴度为1.29×1010PFUml。病毒感染细胞后第3d,细胞培养液内有高浓度的β-内啡呔。结论:成功构建了含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒,为进行下游相关研究奠定了基础。; 徐学武俞卫锋王星华李泉董刚吴飞翔; 关键词：Β-内啡呔腺病毒腺相关病毒

慢性疼痛基因治疗相关研究的进展被引量：3: 2006年; Chronic pain is associated with alterations of neuronal systems involved in pain processing.Some suffering patients are not satisfactorily managed with currently available treatments.However,advances in the field of vector systems which have lower levels of inflammatory and immune responses,along with significant increases in our understanding of pain generating mechanisms and knowledge of tight control of transgene expression,will make gene-based approaches for the future management of pain a conceivable reality.; 董刚俞卫锋; 关键词：慢性疼痛基因治疗中枢敏化感觉神经纤维花生四烯酸预警信号

表达人内啡肽的腺病毒腺相关杂合病毒的构建及体外表达分析被引量：1: 2005年; 应用分子生物学方法将人β_内啡肽融合基因序列克隆入腺病毒穿梭质粒pDC312_AAVEE,后者与骨架质粒共转染HEK293细胞,包装得到含转基因腺病毒腺相关杂合病毒AdAAV_EE。用PCR方法对杂合病毒进行鉴定,TCID50法测定病毒滴度。杂合病毒感染体外培养细胞观察转基因表达,ELISA法测定培养液中表达产物浓度。PCR法证实转基因正确插入了杂合病毒基因组内,且没有野生型病毒污染,病毒滴度为1.29×1010PFUmL。结果表明转基因从第1天到第14天的表达水平呈上升趋势,第14天达到3141pgmL。; 徐学武俞卫锋崔贞福王星华李泉吴飞翔董刚姜梨华; 关键词：Β-内啡肽腺病毒腺相关病毒

小鼠神经生长因子前导肽和人内吗啡肽-2融合基因重组腺病毒载体的构建与鉴定被引量：1: 2007年; 目的:制备并鉴定携带小鼠神经生长因子前导肽(PN)和人内吗啡肽-2(EM-2)融合基因的重组非增殖型腺病毒。方法:PN-EM-2目的基因经酶切插入pAxCAwt载体,构建PN-EM-2-pAxCAwt重组黏粒,脂质体转染293细胞获取重组腺病毒。PCR鉴定后扩增不含野生型病毒的阳性克隆并纯化,采用TCID50法测定病毒滴度;体外感染NIH3T3细胞观察转基因的表达,酶联免疫反应(EIA)法测定表达产物浓度。结果:融合基因序列正确,PCR可检测到401bp的融合基因条带并排除野生病毒株,腺病毒Ad-PN-EM-2滴度为2.03×1010pfu/ml。NIH3T3细胞转染病毒后,细胞培养液内可检测到EM-2的表达,明显高于空转染及未转染细胞(P<0.05),且随时间的延长,表达水平逐渐上升。结论:成功构建能够在非神经内分泌细胞内转基因表达成熟人EM-2的非增殖型腺病毒,为进一步将其应用于慢性疼痛的基因治疗奠定了基础。; 吴飞翔俞卫锋黄盛东徐学武龚德军董刚袁扬孙玉明; 关键词：神经生长因子腺病毒科

重组病毒rAAV2-PD-L1的构建及其转染小鼠血管内皮细胞的生物学效应: 2006年; 目的:构建腺相关病毒rAAV2介导的PD-L1表达系统,检测感染rAAV2-PD-L1的血管内皮细胞共刺激T细胞分泌细胞因子的作用。方法:以鼠肝脏组织来源的总RNA为模板,应用RT-PCR扩增PD-L1 cDNA,克隆入穿梭质粒pSNAV1,脂质体法转染包装细胞BHK21,筛选获得重组病毒rAAV2-PD-L1。以rAAV2-PD-L1感染小鼠血管内皮细胞株2F-2B后,与活化的小鼠T细胞共培养,ELISA法检测培养上清IFNγ浓度。结果:测序结果表明,克隆的小鼠PD-L1 cDNA和重组质粒pSNAV-PD-L1序列正确。重组病毒rAAV2-PD-L1经PCR扩增出目的基因片段,在SDS-PAGE电泳上显示AAV2三条特征带,纯度大于98%。病毒物理滴度为4×1012virus genome/ml;蛋白浓度为0.355 mg/ml。感染rAAV2-PD-L1的血管内皮细胞高表达PD-L1。活化T细胞与其共培养后,培养上清IFNγ浓度显著降低。结论:构建的重组病毒rAAV2-PD-L1可感染血管内皮细胞,并且共刺激可抑制活化T细胞分泌IFNγ。; 康晓燕王孟龙董刚李瑾钱海华殷正丰; 关键词：PD-L1 腺相关病毒内皮细胞

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董刚