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中华大蟾蜍“高温卵”cDNA文库的构建: 2001年; 以长足但不具成熟潜能的中华大蟾蜍“高温卵”为材料 ,提取总RNA和mRNA ,以NotI/OligodT18为引物 ,经反转录合成第 1链cDNA ;再以DNAPolymeraseI合成第 2链 .所得到的cDNA加装衔接头后定向克隆到λ ExCell载体上 ,构建cDNA文库 .结果显示 ,平均每个“高温卵”中总RNA的含量为 5.66μg ,polyA+RNA含量约为 63 .96ng ,构建的cDNA文库的丰度为 8.93×1 0 - 5 pfu/ μgcDNA .随机挑选的 2个重组噬菌体经NotI、EcoRI双酶切后 ,均能酶切出外源片段 ,说明我们已成功地构建了中华大蟾蜍“高温卵”; 孔维华顾正潘勇左嘉客; 关键词：中华大蟾蜍 CDNA文库

一种早胚发育促进因子“DPF-1”cDNA的表达、纯化及其抗体的制备被引量：2: 2001年; 目的 :表达纯化 GST-DPF-1融合蛋白 ,制备抗 DPF-1抗体 ,用抗 DPF-1抗体进行功能封闭实验。方法 :用 Eco RI和 Not I双酶切 p Bluescript IIKS/ 1 .9kb DPF-1 c DNA,得到1 .9kb DPF-1 c DNA;Hinc II酶切该片段 ,得到 1 .8kb DPF-1 c DNA;Sma I与 Not I双酶切 GST融合基因表达载体 p GEX-4T-3 ,得到线性 p GEX-4T-3载体 ;1 .8kb DPF-1 c DNA与线性 p GEX-4T-3载体连接 ,构建了重组 p GEX-4T-3 / DPF-1 c DNA。带有重组质粒的DE3菌 3 7℃培养 ,IPTG诱导 ,菌体裂解及蛋白纯化。融合蛋白免疫 BAL B/ c小鼠 ,制备抗血清 ,抗血清经 GST吸附。结果 :获得的 GST-DPF-1融合蛋白和针对 DPF-1的抗体具有较好的专一性。经 GST吸附后的抗 DPF-1抗血清可使条件培液中的昆明小鼠受精卵全部被阻断于 2 -细胞期。结论 :该抗体可用于天然 DPF-1的纯化、DPF-1功能及作用机制的研究。; 潘勇顾正王俊茹左嘉客; 关键词：抗体胚胎 CDNA

人输卵管蛋白全长cDNA克隆及真核细胞中的表达: 2003年; 目的:克隆人输卵管蛋白(hOviductin)全长cDNA序列,真核细胞中表达,并了解hOviductin是否与大鼠卵母细胞结合。方法:构建人输卵管黏膜上皮细胞cDNA文库,以^(32)P标记的兔输卵管蛋白全长cDNA序列为探针,自文库中筛选hOviductin全长cDNA序列。将获得的hOviductin编码区cDNA序列插入pEGFP-N1真核表达载体,转染HeLa细胞,表达分泌重组的绿色荧光蛋白(EGFP)-hOviductin,并估量其浓度。激光扫描共聚焦显微镜下观察EGFP-hOviductin与大鼠卵巢的卵丘细胞-卵母细胞复合物(COC)或去除透明带后的裸卵的结合情况。结果:所构建的cDNA文库重组率为98.5％,滴度为1.1×10~6pfu/mL。克隆所得hOviductin全长cDNA约为2500 bp,Gen-Bank的登录号为AY189737。EGFP-hOviductin在条件培液中的浓度为0.236 nmol/L,能结合在去透明带的大鼠裸卵质膜外表面,而未见其与COC结合。结论:hOviductin能在HeLa细胞中表达分泌,其分泌产物可结合于大鼠裸卵质膜外表面。; 罗金平潘勇颜桂军顾正左嘉客; 关键词：克隆

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潘勇