葛亚文
- 作品数：3 被引量：6H指数：2
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- 来源于产气肠杆菌的嘧啶核苷磷酸化酶基因在大肠杆菌BL21中的表达被引量：3
- 2007年
- 实现产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)嘧啶核苷磷酸化酶(Pyri midine-nucleoside phosphoryl-ase,PyPNase)基因在大肠杆菌中的高效表达。用来源于产气肠杆菌的核苷磷酸化酶N末端序列与NCBI中公布的已知序列进行比对,设计一对引物,以该菌株基因组DNA为模板扩增出PyPNase基因。定向克隆到PET-28a(+)载体后转化到表达宿主大肠杆菌BL21中,筛选阳性克隆并测序,然后在LB培养基中优化发酵条件。结果:目的基因片断长度为1 302 bp。表达产物经SDS-PAGE和酶活测定表明PyPNase基因在大肠杆菌中获得活性表达,43 ku处有表达蛋白。37℃培养2 h至对数生长中期,降温到31℃,0.1 mmol/L IPTG诱导5h获得最大酶活力为512.3 U/mg,为出发菌株的17.2倍。重组PyPNase的成功表达为今后大规模生产5-FUR打下了基础。
- 魏元刚倪孟祥葛亚文吴梧桐
- 关键词：嘧啶核苷磷酸化酶克隆表达大肠杆菌产气肠杆菌发酵条件
- 5-氟尿苷生物转化率的影响因素研究被引量：3
- 2006年
- 目的:利用产气肠杆菌EAM-Z1转化合成5-氟尿苷(5-FUR),并对影响5-FUR转化率的因素进行了考察。方法:以磷酸盐缓冲液(PBS)为溶剂的5-FUR的转化率为对照,考察反应溶剂Na2SO4溶液、中间体稳定剂、金属离子、固定化细胞、粗酶液等因素对转化率的影响。结果:以Na2SO4溶液为溶剂进行转化,转化率可提高10%左右;双中间体稳定剂硼砂+硼酸使转化率提高20%左右;Mg2+和Zn2+可提高产物的转化率,在以PBS为溶剂的转化反应中,1 mmol/L Mg2使转化率提高了11.31%,以Na2SO4溶液为溶剂的转化反应中,4 mmol/L Zn2+使转化率提高了9.43%;以固定化细胞进行生物转化,反应时间缩短为1 h,但转化率略有降低;以粗酶液进行生物转化,反应时间为4 h,转化率提高21.29%。结论:5-FUR的转化率受多种因素的影响,合理的反应溶剂如Na2SO4溶液、中间体稳定剂、金属离子、提取酶粗提液等方法均可以较显著的提高5-FUR的转化率。
- 葛亚文倪孟祥魏元刚王旻
- 关键词：产气肠杆菌嘧啶核苷磷酸化酶生物转化转化率
- 影响产气肠杆菌EAM-Z1中嘧啶核苷磷酸化酶活力的因素被引量：1
- 2007年
- 目的:研究影响产气肠杆菌EAM-Z1的嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)酶活力的因素。方法:分别考察添加底物、金属离子、速效碳源和磷酸盐对菌体浓度及PyNPase活力的影响。结果:加入4 g/L胞苷,菌体的量增加了19.30%,综合考虑对菌体量和比酶活,加入3 g/L胞苷可使PyNPase活力增加10.46%;4 mg/L Ca2+使菌体量增加了10.90%,PyNPase活力增加了30.25%;低浓度的速效碳源可以增加菌体浓度,但均使PyNPase的活力降低;1 g/L磷酸盐使PyNPase活力增加了17.40%。结论:底物诱导、金属离子、速效碳源和磷酸盐均对PyNPase的活力有一定的影响。
- 倪孟祥葛亚文吴梧桐
- 关键词：产气肠杆菌嘧啶核苷磷酸化酶酶活力
