曹俊
- 作品数：15 被引量：33H指数：3
- 供职机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划公益性行业科研专项更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 结核分枝杆菌rv3295基因的原核表达及单克隆抗体的制备被引量：1
- 2015年
- 以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增了rv3295基因;将其克隆至表达载体pET-22b中,构建了重组质粒pET-22b-Rv3295;将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达出了Rv3295蛋白。通过亲和层析纯化,以该重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合筛选制备抗该重组蛋白的单克隆抗体;采用Western-blot验证单克隆抗体的特异性;通过亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型。结果显示,Rv3295蛋白以可溶形式表达,蛋白质的分子质量大小为25ku。获得1株抗该重组蛋白的单克隆抗体1F7,其亚型为IgG1/κ;Western-blot结果显示,该抗体具有较好的特异性。本研究制备的Rv3295蛋白的单克隆抗体对于研究Rv3295蛋白的功能及其与DNA之间的互作奠定了基础。
- 崔莹莹宋宁宁党光辉曹俊李华芳于申业刘思国
- 关键词：结核分枝杆菌原核表达单克隆抗体
- 结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒的构建及鉴定
- 2014年
- 为了构建结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒,本研究利用重叠延伸PCR技术扩增出rv3802c-HisFlag基因片段,将其克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)上,测序验证后,将基因合成的内部核糖体进入位点和增强型红色荧光蛋白基因片段(IRES-DsRed2)定向插入到这个重组质粒上,经酶切鉴定获得双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red。将质粒pC3.1-3LHF-Red转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,通过荧光显微镜观察到增强型红色荧光蛋白成功表达;经Western blot分析表明Rv3802c-HisFlag融合蛋白在CHO细胞中获得了表达。结果表明,本研究成功构建了共表达增强型红色荧光蛋白和Rv3802c-HisFlag融合蛋白的双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red,为进一步研究结核分枝杆菌Rv3802c蛋白在分枝杆菌感染细胞过程中的作用奠定基础。
- 张娈娈陈利苹曹俊崔保亮李华芳刘思国
- 关键词：CHO细胞
- 猪链球菌细菌素基因膜接合转移的研究被引量：2
- 2022年
- 为研究猪链球菌细菌素基因能否在同种和不同种属之间转移,本研究对供体菌xj-144的红霉素耐药基因ermB和四环素耐药基因tetO进行PCR鉴定,然后以携带猪链球菌细菌素基因的菌株xj-144为供体菌,分别以猪链球菌BAA和粪肠球菌JH2-2株为受体菌进行膜接合转移试验,并对接合子进行PCR检测,对经检测正确的接合子进行药敏试验,同时对接合子的细菌素基因簇和供体菌的可移动遗传元件经PCR鉴定,并对整合性接合元件进行基因序列分析。结果显示,供体菌xj-144携带红霉素耐药基因ermB和四环素耐药基因tetO,与受体菌BAA和JH2-2株分别进行滤膜接合转移试验后正确获得了接合子BM-1和JM-1,接合效率分别为8×10;和8×10^(-7)。药敏试验结果显示,供体菌xj-144对红霉素和四环素耐药,受体菌BAA和JH2-2株对红霉素和四环素均敏感,接合子BM-1和JM-1均对红霉素和四环素耐药。且接合子经PCR均扩增出了猪链球菌细菌素的suicin65基因簇;同时,从供体菌和接合子中均经PCR扩增到转座子整合酶int基因;序列分析结果显示,细菌素基因簇与耐药基因ermB、tetO共定位于一个新的整合性接合元件ICESsuxj-144中。上述结果首次证实了猪链球菌细菌素基因可以跨种属水平转移,并且该基因的水平转移与转座子有密切关系,本研究为进一步探究细菌素基因的转移提供了参考依据。
- 王凌利杨亲祝瑶杨文琳曹俊刘思国张万江
- 关键词：基因水平转移转座子
- 猪链球菌细菌素的筛选及理化特性分析被引量：2
- 2022年
- 为研究猪链球菌(SS)产生的细菌素,本研究以不同省份分离到的200株SS为研究对象,采用琼脂扩散法筛选具有抑菌作用的菌株;通过CGE网站进行ST型分型,利用PCR方法进行血清型分型;选出的菌株利用PCR方法检测细菌素相关基因;然后用BAGEL4对细菌素相关基因进行全序列基因功能分析,同时采用PCR分段扩增其基因簇;并分析SS所产细菌素的理化特性。结果显示,从200株SS中筛选出了21株可产生抑菌物质的SS,它们分布于不同的ST型和血清型。其中菌株xj-144和38-3携带SS细菌素编码基因sss基因和suiA基因,经BAGEL4分析菌株xj-144仅存在一个与suicin 65核心肽相同的细菌素,并无其他潜在细菌素,其完整的基因簇含有10个ORFs,产生的细菌素排除有机酸、过氧化氢干扰后,其粗提取液具有一定的耐热性、酸碱耐受性和蛋白酶稳定性,并对部分病原菌具有抑菌作用。本研究为进一步研究SS细菌素奠定了一定的基础,为实现细菌素替代传统抗生素提供了科学参考。
- 王凌利杨亲祝瑶杨文琳曹俊刘思国张万江
- 关键词：细菌素猪链球菌基因簇
- 鸡白痢沙门氏菌PCR检测方法的建立被引量：3
- 2021年
- 为建立鸡白痢沙门氏菌(S.Pullorum)的快速PCR检测方法,本研究通过比对S.Pullorum ATCC 9120株和其他14株常见沙门氏菌及部分禽大肠杆菌的全基因组序列,在S.Pullorum ATCC 9120株SEEP 011400~SEEP011405处缺失一段约10 kb碱基的区域,在此区域的侧翼序列设计并筛选了一对特异性引物,经反应条件的优化,建立了一种能够直接从鸡蛋样品中特异性检测S.Pullorum的PCR方法。并对该方法检测模拟鸡蛋样品的敏感性进行了评价,结果显示:该方法可以针对S.Pullorum特异性的扩增出576 bp的条带,而对其他常见致病性沙门氏菌血清型(31株)和非沙门氏菌(11株)均无扩增条带。该方法对S.Pullorum菌液检测的敏感性为10^(2)cfu/mL,利用本研究建立的方法直接检测污染S.Pullorum的鸡蛋样品时的最低检测限为10^(4)cfu/mL,且只需增菌8 h后,即可检测到10^(2)cfu/mL的S.Pullorum。利用该方法与其他PCR方法对模拟鸡蛋样品进行检测,对比检测结果,结果显示该方法敏感性为10^(4)cfu/mL,高于其他PCR方法。利用该方法对229份临床样品进行检测,结果显示阳性检出率为3.06%(7/229),与其他检测方法结果相符。本研究建立的S.Pullorum鉴别检测方法具有较高的特异性与敏感性,并且能够快速检测出鸡蛋中的S.Pullorum,为S.Pullorum的检测提供了一种快速、有效的方法。
- 陆瑶丁仕豪曹俊刘思国于申业
- 关键词：鸡白痢沙门氏菌PCR
- 结核分枝杆菌rv3668c基因的原核表达及多抗制备被引量：1
- 2013年
- 以结核分枝杆菌强毒株H37Rv基因组DNA为模板,扩增rv3668c基因,将其连接于表达载体pET-30a(+),获得重组质粒p30a-68,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用1mmol/L IPTG诱导表达组氨酸标签融合蛋白His-Rv3668c。用Ni-NTA His-Bind Resin亲和层析树脂纯化目的蛋白,利用抗6His标签抗体验证蛋白的纯化结果;通过Western-blot分析纯化蛋白与牛结核病阳性血清的反应情况。用重组蛋白纯化产物免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,重组质粒的双酶切鉴定和DNA序列测定均完全正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,His-Rv3668c以可溶形式表达,蛋白质分子质量为26ku;纯化的蛋白能与牛结核病阳性血清发生反应,表明其具有很好的免疫原性。所制备的多克隆抗体也具有良好的特异性,可运用于对Rv3668c蛋白的功能特性研究。
- 鄢秋龙陈利苹刘银冰曹俊倪宏波刘思国
- 关键词：结核分枝杆菌原核表达免疫原性
- 结核分枝杆菌rv0394c基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其粘附特性的鉴定被引量：2
- 2015年
- 本实验室前期研究鉴定出结核分枝杆菌的rv0394c基因产物具有透明质酸酶的活性,但对于该酶在分枝杆菌致病中的作用尚不清楚。为了鉴定该蛋白对细胞是否具有粘附特性,本研究利用大肠杆菌表达纯化的重组蛋白RV0394c与人肺泡上皮细胞(A549细胞)互作,通过激光共聚焦显微镜观察到蛋白对细胞的特异性粘附。为进一步验证该试验结果,将rv0394c基因克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒p MV262中,将重组质粒电转化于非致病性的耻垢分枝杆菌中进行表达。构建的重组菌与A549细胞进行互作,结果表明重组菌可以粘附于A549细胞表面,而且这种粘附能够被RV0394c重组蛋白所阻断,这些结果表明RV0394c蛋白具有粘附细胞的能力,属于该菌的粘附蛋白之一。RV0394c蛋白粘附特性的鉴定为进一步研究该蛋白在致病性中的作用提供了实验依据。
- 李华芳曹俊刘松艳陈利苹刘思国
- 关键词：结核分枝杆菌耻垢分枝杆菌粘附
- 以结核分枝杆菌为研究模型的自噬免疫学效应
- 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)已造成全球超过10亿人的无症状感染,每年新增数百万的活动病例,病死率达到25%~30%。M.tb最重要的一个特点是:M.tb能够阻断巨噬细胞中...
- 曹俊陈利苹鄢秋龙刘思国
- 关键词：结核分枝杆菌自噬结核病
- 文献传递
- 结核分枝杆菌rv3036c基因的原核表达及其多克隆抗体的制备
- 本研究以结核分枝杆菌强毒株H37Rv基因组DNA为模板，扩增rv3036c基因，将此基因片段连接于表达载体pET-28a(+)，获得重组质粒pET-28a-ru3036c，并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，...
- 陈利苹曹俊刘银冰鄢秋龙刘思国
- 关键词：结核分枝杆菌原核表达多克隆抗体蛋白纯化
- 文献传递
- 鸡白痢沙门氏菌与其它致病性沙门氏菌的血清型特异性PCR鉴别检测方法的建立被引量：16
- 2017年
- 为建立鸡白痢沙门氏菌与其他常见致病性沙门氏菌的血清型特异性快速PCR检测方法,本研究通过对Gen Bank中鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌全基因组进行生物信息学分析,确定SEEP17495基因为鸡白痢沙门氏菌的检测靶基因,设计特异性引物,建立了一种能够直接从粪便样品中检测鸡白痢沙门氏菌的PCR检测方法。结果显示:该方法对于两株鸡白痢沙门氏菌均可以特异性地扩增出356 bp的目的片段,但对于7株常见非沙门氏菌致病菌和29株其他常见致病性沙门氏菌血清型的扩增结果均为阴性。该方法无论检测鸡白痢沙门氏菌纯培养菌,还是检测模拟鸡粪样品中的鸡白痢沙门氏菌,检测的灵敏度均为103cfu/m L。本研究建立的PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏性,并且能够快速检测出粪便样品中的鸡白痢沙门氏菌,为鸡白痢沙门氏菌的检测提供了一种快速、有效的方法。
- 张童利王曼宇曹俊王忠星刘思国于申业
- 关键词：鸡白痢沙门氏菌PCR
