梁耀东
- 作品数：39 被引量：73H指数：6
- 供职机构：解放军第302医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, State Education Ministry更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 淋巴细胞内与乙型肝炎病毒X蛋白结合的新蛋白X-30编码基因的克隆
- 2003年
- 目的:为探讨 HBxAg 在 HBV 致病过程中的作用,筛选并克隆人淋巴细胞 cDNA 文库中与 HBxAg 有相互作用的蛋白基因.方法:利用酵母双杂交系统3筛选并克隆人淋巴细胞 cDNA文库中与 HBxAg 有相互作用的蛋白的基因.将 HBxAg 编码基因连接入酵母表达载体 pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞 AH109并在其内表达,然后与转化了人淋巴cDNA 文库质粒 pACT2的酵母细胞 Y187进行配合,双重筛选阳性菌落,提取质粒并测序,结果进行生物信息学分析,发现其中有1个未知基因.根据 GenBank 中的序列信息设计引物,从 HepG2细胞提取总 RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为 X-30,在 GenBank 中注册,注册号为AY280722.结果:X-30基因的编码序列全长为315个核苷酸(nt),编码产物由103个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBxAg 与淋巴细胞结合蛋白新型基因 X-30的筛选与克隆,为进一步研究 HBxAg 的分子生物学机制及探索新型治疗技术奠定了基础.
- 梁耀东李强成军王琳陆荫英吴君程明亮
- 关键词：淋巴细胞乙型肝炎病毒X蛋白克隆分子生物学机制逆转录多聚酶链反应
- 乙肝病毒表面抗原基因启动子Ⅱ的结构及调节研究被引量：7
- 2003年
- 0引言
乙型肝炎病毒(HBV)为含有一段单股区的双链环状DNA病毒,属嗜肝DNA病毒科,其基因组结构紧密,可分为结构基因序列和调节基因序列两部分,二者可具有相互重叠的特点.HBV基因的负链核苷酸序列中,至少有4个开放读码框(open reading frame,ORF),包括编码外膜蛋白的S基因区,编码核衣壳蛋白的C基因区,编码聚合酶的P基因区和调节病毒基因转录水平的X基因区,4种ORF分别有各自的启动子.HBV的外膜蛋白能使病毒由感染的细胞分泌,并能附着和侵入新的细胞;同时其也是引起宿主保护性应答的免疫原表位[1-6].因此,作为指导S基因组RNA转录的SP启动子序列,在HBV的生活周期中,具有较为重要的作用.
- 梁耀东成军陆荫英吴君程明亮
- 关键词：乙肝病毒表面抗原基因突变基因表达
- 应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与NS5ATP9蛋白结合蛋白的编码基因被引量：2
- 2004年
- 目的:我们在以往的研究中,应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选得到了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9),NS5ATP9是一种未知功能新基因.为了进一步研究NS5ATP9的生物学功能,应用酵母双杂交技术, 筛选并克隆人白细胞中与NS5ATP9蛋白相互作用蛋白的基因,进一步阐明NS5ATP9的生物学功能及其作用途径. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP9基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出NS5ATP9基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基上生长,又能在铺有C-α-gal的四缺培养基上变蓝的真阳性菌落46个,其中含人类免疫球蛋白轻链13个,核小体表面蛋白10个,铁蛋白重链2个,人类重组免疫球蛋白λ轻链11个,14-3-3家族蛋白1个,脑膜炎球菌PorA蛋白1 个,RNA多聚酶Ⅲ3个,烟草有丝分裂原激活蛋白激酶1 个,细胞色素P450Ⅱ2个,SLIT2蛋白1个,DNA依赖蛋白激酶催化亚基1个. 结论:成功克隆出丙型肝炎病毒NS5ATP9蛋白的结合蛋白,为进一步研究NS5ATP9的生物学作用提供了新的线索.
- 李强梁耀东成军王琳张建邵清刘敏程明亮
- 关键词：酵母双杂交技术白细胞抑制性消减杂交技术SSH编码基因酵母细胞
- 应用白细胞cDNA文库的酵母双杂交技术筛选HCTP4结合蛋白基因被引量：1
- 2004年
- 目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与HCTP4蛋白结合的蛋白的编码基因. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCTP4基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α), 提出质粒并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出HCTP4基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α- 半乳糖(X-α-gal)的四重缺陷培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落44个,其中25个免疫球蛋白λ轻链:6个来自RP11-189K21克隆的人DNA序列;4个来自RP11- 507C10克隆的人DNA序列;2个人BAC克隆RPCI11- 75L1;1个人BAC克隆RP11-21M10;1个人遍素酶智能弹(MIB);1个来自RP11-867O8克隆的人DNA基因;1个来自RP3-509119克隆的人DNA序列;1个小核糖核蛋白G: 1个UMP-CMP激酶;1个新基因. 结论:成功克隆出HCTP4的结合蛋白,为进一步研究丙型肝炎病毒(HCV)的作用提供了新线索.
- 刘敏成军张树林王琳邵清张健梁耀东
- 关键词：白细胞CDNA文库酵母双杂交技术丙型肝炎病毒HCV
- 应用酵母双杂交技术筛选白细胞cDNA文库与NS5ATP1结合蛋白基因被引量：4
- 2004年
- 目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与NSA5TP1结合蛋白的编码基因. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP1基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出NS5ATP1基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X- α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落10个,其中2个人HLA-B27;2个人亚砷酸盐转移子(arsA);1个人单倍型E22i线粒体;1个人pyrin (MEFV);1个人肌动蛋白素1(cofilin 1);1个人染色体15; 1个来自RP11-353N14克隆人的DNA基因,位于染色体17;1个新基因. 结论:成功克隆出NS5ATP1的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
- 刘敏成军张树林王琳邵清张健梁耀东
- 关键词：酵母双杂交技术白细胞CDNA结合蛋白基因
- 酵母双杂交技术筛选肝细胞中与乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白C-12相互作用蛋白的研究被引量：4
- 2003年
- 目的:筛选并克隆人肝细胞中与 HBcAg 肝细胞结合蛋白 C-12新基因相互作用蛋白的基因,进一步探讨 HBcAg 结合蛋白 C-12新基因的生物学功能.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增 C-12基因,连接入酵母表达载体 pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝 cDNA 文库质粒pACT2的酵母细胞 Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和 X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出 C-12基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-gal 的四缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落21个,其中含金属硫蛋白 A2基因的菌落有3个、组织蛋白酶 B 基因1个、载脂蛋白 M 基因1个、细胞色素 C 氧化酶Ⅱ基因3个、人类受体蛋白酪氨酸激酶变异因子基因1个、KH 型剪接调控蛋白基因1个、磷脂酰肌醇脱酰酶聚糖Q 转录变异因子1基因1个、铁蛋白轻链基因2个、鸟氨酸脱羧酶1基因1个、血液凝固因子Ⅸ基因1个、乙酰乳酸合酶基因1个、钙激活蛋白酶基因1个、核外三磷酸盐双磷脂酰水解酶5基因1个、血浆α-球蛋白抑制因子 H4基因1个和未知蛋白基因2个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白 C-12新基因相互作用蛋白的编码基因,为进一步研究 HBcAg 在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供 (?)新线索.
- 梁耀东陆荫英成军李强王琳吴君程明亮
- 关键词：酵母双杂交技术肝细胞乙型肝炎病毒多聚酶链反应
- 酵母双杂交技术筛选人白细胞中与乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白基因被引量：2
- 2003年
- 目的:筛选并克隆人白细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)X 蛋白(HBxAg)相互作用蛋白的基因,进一步探讨 HBxAg 的生物学功能.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增 HBxAg 基因,连接入酵母表达载体 pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人淋巴 cDNA 文库质粒 pACT2的酵母细胞 Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和 X-α-半乳糖(X-α-gal)上双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出 HBxAg 基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有 X-α-gal 的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落50个,其中含真核翻译延伸因子2基因20个,真核翻译延伸因子1基因1个,真核翻译起始因子3基因2个,急性髓样白血病 MTG8蛋白基因2个,髓样关联分化蛋白基因1个,髓样分化主反应蛋白基因1个,皮肤 T 细胞淋巴瘤肿瘤抗原基因1个,大组织相容性复合物 Ib 抗原基因3个,白细胞抗原 CD37基因1个,慢性白细胞性白血病相关抗原基因1个,α白细胞整联蛋白基因1个,生长停止和 DNA 损伤诱导因子34基因1个,转录变异因子1基因2个,蛋白磷酸酶1调控抑制因子15A 基因1个,单核细胞系胞苷脱氨酶基因1个,巨噬细胞钙离子依赖型凝集素2基因1个,KIAA1949蛋白基因3个,尿激酶型血浆素原激活剂基因1个,GDP 分解抑制因子基因3个,软骨素4磺基转移酶基因1个,锌指蛋白1A 亚目基因1个和未知蛋白基因1个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒 X 蛋白的结合蛋白,为进一步研究 HBxAg 的生物学作用提供了新的线索.
- 梁耀东成军李强王琳陆荫英吴君程明亮
- 关键词：酵母双杂交技术白细胞乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白生物学功能
- 酵母双杂交技术筛选白细胞中HCVNS3蛋白结合蛋白基因被引量：5
- 2003年
- 目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增 NS3基因,连接入酵母表达载体 pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞 Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出 NS3基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有 X-α-半乳糖(x-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落18个,其中4个真核细胞翻译延伸因子2;2个免疫球蛋白λ轻链;1个肌动蛋白β;1个铁蛋白轻多肽;1个(丝裂原)活化蛋白激酶3;2个肌球蛋白因子1;1个白介素2受体β;1个富含精氨酸/丝氨酸剪切因子6;1个组织蛋白酶 S;1个2’-5’寡腺甘酸合成酶类似物;1个缺失精子缺乏相关蛋白2;1个 CNN2;1个新基因.结论:成功克隆出 HCV NS3的结合蛋白,为进一步研究HCV 的作用提供了新线索.
- 邵清成军白雪帆王琳张健梁耀东刘敏李强
- 关键词：酵母双杂交技术白细胞丙型肝炎病毒多聚酶链反应
- 应用表达谱芯片技术筛选NS5ATP9反式调节基因的研究被引量：3
- 2004年
- 目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9)的反式调节基因.方法:构建NS5ATP9基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP9,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NSSATP9转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体pcDNA3.1(-)的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP9后,有16条差异基因表达水平发生显著改变,其中3条基因表达增强,13条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化、凋亡及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了丙型肝炎病毒NS5ATP9作用HepG2细胞后差异表达基因,为阐明NS5ATP9的作用提供了新的依据.
- 李强梁耀东成军王琳王建军张健刘妍程明亮
- 关键词：肝炎病毒HCV基因功能丙型肝炎
- 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP5的克隆被引量：2
- 2003年
- 目的:应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白5A(HCV NS5A)反式激活新型靶基因.方法:以 HCV NS5A 表达质粒 pcDNA3.1(-)-NS5A 转染HepG2细胞,以空载体 pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA 并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与 GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的 Kozak 规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从 HepG2细胞提取总 RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为1191个核苷酸(nt),编码产物由396个氨基酸残基(aa)组成.命名为NS5ATP5,在 GenBank 中注册,注册号为 AF529366.结论:HCV NS5A 反式激活新型靶基因 NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究 HCV NS5A 反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.
- 张健刘妍成军王琳邵清梁耀东刘敏
- 关键词：丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因基因克隆
