李天明
- 作品数：23 被引量：23H指数：3
- 供职机构：河北科技大学更多>>
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- 相关领域：生物学化学工程轻工技术与工程农业科学更多>>
- 代谢工程改造Corynebacterium glutamicum生产L-苹果酸被引量：1
- 2016年
- 以提高L-苹果酸的产量为目标,采用一次交换两次同源重组的方法,利用反向筛选标记,在敲除了丙酮酸醌氧化还原酶编码基因(pqo),丙酮酸脱氢酶编码基因(pdh)和乳酸脱氢酶编码基因(lldh)的C.glutamicumΔpqoΔpdhΔlldh(C.glutamicumΔPPL)基础上,无痕敲除了L-苹果酸积累支流代谢途径的2个关键酶基因:苹果酸醌氧化还原酶编码基因(mqo)和苹果酸酶编码基因(male),同时敲入了苹果酸分泌转运蛋白基因(transb),获得了产L-苹果酸的工程菌株;采用高效液相色谱法检测了工程菌株C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale的发酵产物。实验结果表明:C.glutamicum ATCC 13032发酵后不积累L-苹果酸,而工程菌C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale发酵48 h,积累了12.8 g/L的L-苹果酸,工程菌的糖酸转化率为33.18%,为利用C.glutamicum ATCC 13032发酵生产L-苹果酸提供了基础遗传资源。
- 赵一李天明刘金雷王崇慧仪宏冯惠勇
- 关键词：L-苹果酸基因敲除基因敲入
- 在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因及其构建方法
- 本发明公开了在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因及其构建方法，通过分析5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的限速步骤、中间体供给及产物分泌等问题，克隆<I>Rhodobactersphaeroides</I>...
- 冯惠勇刘天佳李天明戴宝新刘静文
- 文献传递
- 代谢工程改造Gluconobacter suboxydans生产2-酮基-D-葡萄糖酸被引量：1
- 2014年
- 2-酮基-D-葡萄糖酸是重要的抗氧化剂和食品添加剂——D-异抗坏血酸的重要前体。弱氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter suboxydans)具有丰富的周质空间氧化还原酶类,可将葡萄糖氧化为葡萄糖酸再氧化为2-酮基-D-葡萄糖酸。以提高2-酮基-D-葡萄糖酸的产量和减少副产物为目标,采用同源重组染色体修饰策略,将编码甘油脱氢酶的基因gldh置换为编码葡萄糖脱氢酶的基因gdh,将编码山梨醇脱氢酶的基因sdh置换为编码2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶的基因ga-2-dh。经PCR、酶活性显色及发酵产物HPLC检测验证表明:构建的工程菌株gdh和ga-2-dh基因被强化而gldh和sdh被敲除;使用10%的葡萄糖复合培养基,摇瓶发酵72h,工程菌2KGA3发酵液中没有副产物5-酮基-葡萄糖酸,2-酮基-D-葡萄糖酸的含量终浓度达到72.3 g/L,比野生菌株提高42.2g/L,工程菌和野生菌的2-D-KGA质量转化率分别为72.3%和30.1%,工程菌比野生菌提高1.4倍。构建获得的工程菌,不需要外加抗生素,可以保持稳定遗传,对于工业化规模生产具有一定优势,为获得可产业化显示的优势遗传资源打下了基础。
- 仪修南李天明王北辰刘金雷杜红燕冯惠勇
- 关键词：2-酮基-D-葡萄糖酸葡萄糖氧化酶
- 利用CRISPRi技术构建乙醛酸生物合成Corynebacterium glutamicum工程菌被引量：1
- 2021年
- 以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)为出发菌株,敲除其支流代谢关键酶乳酸脱氢酶合成基因lldh,建立规律间隔成簇短回文重复序列干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference,CRISPRi)调控体系,并利用该体系下调支流代谢中的关键酶异柠檬酸脱氢酶合成基因icd和苹果酸合成酶合成基因ms的表达强度,同时过表达异柠檬酸裂合酶合成基因icl,强化乙醛酸合成的通路。通过48 h连续监测工程菌和野生菌生长状况,并检测发酵终产物。结果显示:工程菌生长几乎不受影响,发酵液中乙醛酸质量浓度达到5 mg/mL,实现了乙醛酸的积累,为谷氨酸棒状杆菌工业生产乙醛研究提供一定的参考。
- 梁咏思沈凯佳范许云韩武洋李天明
- 关键词：谷氨酸棒状杆菌乙醛酸工程菌
- 构建尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因缺失菌株实现Gluconobacter suboxydans基因组无痕修饰
- 2016年
- 弱氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter suboxydans)可高效不完全氧化多种糖类和醇类等多羟基化合物,生成相应的醛类、酮类和有机酸类等产物,是一类重要的工业微生物。利用同源重组技术对基因组进行修饰改造是工业育种的有效手段。传统方法多选用抗生素为筛选标记,存在诸多缺陷。构建尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因缺失菌株以实现Gluconobacter suboxydans基因组无痕修饰为目标,将自杀质粒p MD18-Jqupp电转化至野生型Gluconobacter suboxydans J12中,通过四环素抗性和5-氟尿嘧啶双重筛选,获得敲除了编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶的基因upp的突变株。经生理验证表明,该突变株在含0.5mg/ml 5-氟尿嘧啶的培养基上生长,而回补upp基因后,在0.5mg/ml 5-F氟尿嘧啶的培养基上不生长。说明获得的G.suboxydans-upp突变株能以upp基因作为负向筛选标记,通过两次同源重组,实现Gluconobacter suboxydans基因组无痕修饰与改造,为今后代谢工程改造Gluconobacter suboxydans获得有价值的工业菌种奠定基础。
- 杜红燕李天明刘金雷冯惠勇
- 关键词：尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因敲除
- 基于CRISPR-Cas9系统的Saccharomyces cerevisiae基因删除被引量：1
- 2019年
- 建立CRISPR-Cas9介导的在Saccharomyces cerevisiae双倍体细胞中进行基因敲除的方法。以can1基因敲除后的表型验证该CRISPR-Cas9系统的有效性,can1基因的失活效率达到4%。利用该系统又分别敲除了pdc、adh3、adh2、adh1、 pdh等基因,单基因编辑效率分别为4/48、3/48、1/48、3/28、1/16。确定了基因连续敲除的方法流程,pdc、adh3、adh2三个基因全部敲除,整个过程用时17 d。探索了双基因一次转化同时敲除的方法,将adh5、lip两个基因同时敲除用时6 d,基因编辑效率分别为9/32和10/32。
- 牛潇迪李天明刘金雷杨天勇李子怡冯惠勇
- 关键词：酿酒酵母基因组工程基因敲除
- 重组酶FLP在弱氧化葡糖杆菌中的表达及应用
- 2014年
- 本实验借助宽宿主载体pBBR1MCS-5,构建在弱氧化葡糖杆菌(Gluconobacter suboxydans)中表达FLP重组酶的表达载体,转化弱氧化葡糖杆菌,获得阳性转化子;采用两步法RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)验证,结果表明:flp基因在宿主细胞中转录表达;将pBBR1MCS-psldh-flp重组质粒转化至带有四环抗性的突变菌株JGDH-,PCR验证表明带有FTR位点的抗性标记得到有效删除。重组酶FLP在Gluconobacter suboxydans的表达提供了一种循环使用选择标记基因进行多个位点基因敲除或置换的方法。
- 刘静文李天明杜红燕冯惠勇
- 关键词：位点特异性重组启动子基因敲除
- 谷氨酸棒状杆菌新型诱导启动子的研究被引量：1
- 2016年
- 以丰富和完善谷氨酸棒状杆菌的表达元件、筛选适合工业化应用的新型诱导启动子为研究目标,借助绿色荧光蛋白GFP为报告基因,构建启动子筛选工具质粒,在谷氨酸棒杆菌中表达,筛选出三种高效表达的诱导启动子.通过检测绿色荧光蛋白表达强度可知:丙酸启动子诱导表达强度最大,葡萄糖酸启动子次之,蔗糖启动子较弱;丙酸启动子最适诱导浓度为60 ug/m L、葡萄糖酸启动子2 mg/m L、蔗糖启动子2 mg/m L,表达强度比无诱导对照组分别增加4.39、3.86、2.74倍.
- 范荣刘金雷韩武洋许湄雪陆浩仪宏李天明
- 关键词：谷氨酸棒状杆菌
- 代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生成丙酮酸被引量：3
- 2016年
- 旨在增加谷氨酸棒杆菌代谢过程中丙酮酸的积累、减少副产物的生成,利用同源重组的方法,敲除了丙酮酸代谢过程中支流代谢途径的关键基因:丙酮酸醌氧化还原酶pqo基因、丙酮酸脱氢酶pdh基因和乳酸脱氢酶lldh基因,获得了基因缺失工程菌株。利用4.5%的葡萄糖复合培养基,工程菌经摇瓶发酵48 h,丙酮酸的浓度达到14.6 g/L,而野生菌株仅为0.45 g/L;工程菌的糖酸转化率为33.18%,比野生菌提高了32.5倍。
- 于莹许湄雪刘金雷范荣冯惠勇李天明
- 关键词：丙酮酸谷氨酸棒状杆菌丙酮酸脱氢酶乳酸脱氢酶
- 毕赤酵母分泌型遗传操作工具的构建与优化
- 2024年
- 为了解决毕赤酵母遗传操作效率低且流程繁琐的问题,提高其应用价值,构建并优化了分泌型遗传操作工具。首先,以α-淀粉酶为报告蛋白,通过融合自主复制序列构建非整合型表达质粒;其次,借助通用引物和POE-PCR,快速筛选评估与目的蛋白最匹配的内源信号肽;最后,构建以亚磷酸盐为唯一磷源的营养依赖型筛选标记。结果表明:2种非整合型质粒表达α-淀粉酶的酶活分别是整合型质粒的2倍和1.6倍;以FLO10、EXG1和MSB 2为信号肽引导的α-淀粉酶酶活分别是常规信号肽α-MF的2.5倍、1.94倍和1.75倍;亚磷酸脱氢酶基因(ptxD)成功筛选出异源表达α-淀粉酶的重组菌株。研究简化了基因操作流程,改进了遗传操作工具,开发的绿色安全且低成本的营养依赖型筛选标记,有助于毕赤酵母分泌表达系统的应用和推广。
- 张梦宇王祎涵李涵李天明冯惠勇
- 关键词：合成生物学毕赤酵母分泌表达复制子信号肽
