秦凤
- 作品数：3 被引量：2H指数：1
- 供职机构：四川大学华西医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 异种移植抗原α-gal介导人血清杀伤A549细胞的实验研究
- 2012年
- 背景与目的人体α-1,3半乳糖基转移酶(α-1,3Galactosy ltransferase,α-1,3GT)基因功能失活而不表达α-半乳糖基(α-galactosyl,α-gal)表位,但天然存在着大量抗α-gal抗体,异种器官移植研究结果提示,在人肿瘤细胞上重新表达异种移植抗原α-gal,可能诱发类似于宿主抗移植物超急性排斥反应的抗肿瘤效应。本研究通过基因导入手段,建立稳定表达异种移植抗原α-gal的转基因人肺癌细胞系,探讨α-gal介导的人血清抗肿瘤的可能性及其机制。方法将前期成功构建的α-1,3GT基因真核表达质粒pEGFP-N1-GT瞬时转染人肺腺癌细胞A549,筛选并建立稳定的转基因细胞系A549-GT。MTT增殖实验和显微镜观察转基因细胞生物学特性变化;RT-PCR检测A549-GT中α-1,3GT基因mRNA表达;荧光素标记的凝集素(FITC-BS-IB4lectin)染色检测α-1,3GT在肿瘤细胞表面合成α-gal的能力;A549-GT细胞及其培养基分别与正常人细胞共培养,检验α-1,3GT基因的稳定性和酶活性的稳定性;人血清结合实验检测A549-GT与IgM和补体C3结合情况。结果RT-PCR检测到转基因细胞系A549-GT中有α-1,3GTmRNA表达。荧光显微镜和流式细胞术检测结果显示:A549-GT能够长期稳定表达异种移植抗原α-gal表位;A549-GT与其亲本细胞在生长形态及增殖速度上无明显差异;A549-GT细胞及其培养基分别与正常人胚肺成纤维细胞MRC-5共培养均不能使MRC-5获得α-gal合成能力;经人血清处理后,荧光免疫实验观察到转基因细胞系A549-GT能与血清抗体IgM结合并诱导补体C3结合。结论异种移植抗原α-gal在肿瘤细胞上的重新表达,可能通过补体依赖的细胞毒机制,介导类似于异种器官移植排斥反应的抗肿瘤效应。
- 朱圣明谢玲郑鸿秦凤刘美骆志国王艳萍
- 关键词：异种抗原A549细胞
- 稳定表达猪α1,3-半乳糖苷基转移酶基因的人肺腺癌细胞系的建立和鉴定被引量：2
- 2010年
- 目的建立稳定表达中国近交系版纳微型猪(BMI)α1,3-半乳糖苷基转移酶基因(α1,3-GT)和α-半乳糖基(Gala1-3Galb1-4GlcNAc-R,α-gal)的人肺癌细胞株,为进一步研究人体血清经补体依赖的细胞毒性作用杀伤表达异种移植抗原的肿瘤细胞提供细胞模型。方法将含有版纳微型猪α1,3-GT基因的pEGFP-CMV-GT质粒经脂质体法体外转染人肺腺癌细胞A549,G418筛选稳定表达的细胞克隆并扩增,命名为A549-GT。用RT-PCR检测A549-GT中α1,3-GT基因的mRNA表达,荧光显微镜和流式细胞仪检测α1,3-GT在细胞膜表面合成α-gal表位的能力以及A549-GT与人血清中Ig M和补体C3结合情况。检测转染细胞形态学、生长增殖能力以及裸鼠成瘤性等生物学特征。结果经G418反复筛选获得了稳定转染α1,3-GT基因的A549-GT的细胞系,该细胞中检测到α1,3-GTmRNA和α-gal表达。A549-GT传代至今已2年,α-gal表达的阳性细胞达80.1%±3.2%。A549-GT细胞能与人血清中的Ig M结合并有补体C3沉积。其生物学特性与亲代A549细胞相比未发生变化。结论成功获得持续稳定表达猪α1,3-GT和α-gal的细胞系A549-GT,为该基因在后续肿瘤免疫治疗中的研究提供有用的细胞研究模型。
- 秦凤朱圣明郑鸿王竹王宇左莹陈娟孙蔚亮王艳萍
- 关键词：A549细胞基因转染
- hTERT启动子调控的异种抗原基因α-1,3GT表达载体的构建及其在肺癌细胞中的靶向表达被引量：1
- 2009年
- 目的:构建人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子调控的异种移植抗原α-1,3半乳糖基转移酶(α-1,3galactosyltransferase,α-1,3GT)基因真核表达载体,研究其调控的α-1,3GT在肿瘤细胞中的靶向表达。方法:将前期克隆并测序正确的猪α-1,3GT基因定向克隆到pEGFP-hTERTp质粒中,构建α-1,3GT真核表达载体pEGFP-hTERTp-GT。分别将pEGFP-hTERTp-GT和CMV启动子调控的α-1,3GT真核表达质粒pEGFP-N1-GT转染端粒酶阳性的人肺癌细胞A549及端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞MRC-5。RT-PCR检测转染细胞中α-1,3GTmRNA的表达,免疫荧光法和流式细胞仪检测α-gal抗原的表达。结果:成功构建了pEGFP-hTERTp-GT真核表达载体。转染pEGFP-N1-GT的A549和MRC-5中均有α-1,3GTmRNA的表达;转染pEGFP-hTERTp-GT的A549中有α-1,3GTmRNA的表达,而端粒酶阴性的MRC-5细胞中无α-1,3GTmRNA的表达。转染pEGFP-N1-GT的A549和MRC-5中均可表达异种移植抗原α-gal;转染pEGFP-hTER-Tp-GT质粒的A549中有α-gal的表达,而MRC-5细胞中无α-gal的表达(P<0.01)。结论:hTERT启动子调控的α-1,3GT基因能靶向性表达在端粒酶阳性的肺癌细胞中,并合成异种移植抗原α-gal。
- 朱圣明郑鸿秦凤王宇王竹骆志国丁珺王艳萍
- 关键词：人端粒酶逆转录酶靶向性表达
