李秀锦
- 作品数：81 被引量：229H指数：8
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- 人CD14信号肽介导卵清蛋白在HEK293T细胞的高效表达
- 2012年
- 本试验将人CD14信号肽序列与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)基因融合,旨在提高OVA在非输卵管上皮细胞中的表达。提取鸡输卵管上皮细胞总RNA,经反转录合成的cDNA,再利用修饰的特异性引物,通过PCR从cDNA中分别扩增出5'端与人CD14信号肽序列融合和非融合的OVA基因,并将它们分别插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成表达载体pcDNA-CD14sp-OVA和pcDNA-OVA。经磷酸钙介导,将质粒转染至HEK293T细胞,使其进行表达,用鼠抗OVA单克隆抗体通过免疫印迹(Western blot)法检测OVA表达水平。结果表明:本试验扩增的OVA基因序列与GenBank中的序列(登录号NM_205152)一致,构建的人CD14信号肽序列融合OVA基因的表达载体结构正确。经过在HEK293T细胞的表达,融合人CD14信号肽序列的重组蛋白OVA的表达水平明显得到提高。结果提示,融合人CD14信号肽序列后的重组蛋白OVA在非输卵管上皮细胞中的表达水平明显提高,为OVA基因作为DNA疫苗模式抗原的应用提供了必要的条件。
- 能昌爱李秀锦仲飞李振张峰陈慧慧张考韩冬梅
- 关键词：卵清蛋白重组蛋白表达
- GFP mRNA在树突状细胞中的转染及其影响因素分析被引量：7
- 2006年
- 目的:探讨绿色荧光蛋白(GFP)mRNA在树突状细胞(DC)中的转染及其影响因素。方法:选用gfp报告基因,在体外利用含T7RNA聚合酶的mMESSAGERNA转录试剂盒,合成含有帽子结构的GFPmRNA,通过酵母多聚A聚合酶加尾,制备结构完整的GFPmRNA。与此同时,从人的外周血液中分离单核细胞,并在体外经GM-CSF和IL-4刺激分化为DC。通过转染试剂介导将合成的GFPmRNA转染到DC内并使其表达。采用流式细胞术检测其转染效率和表达水平。结果:体外合成GFPmRNA,经转染试剂介导,实现了gfp基因在DC中的表达。不同的转染试剂、mRNA用量和细胞密度对mRNA的转染效率有较大的影响。采用Transmes-sengerTransfectionKit转染试剂,1μgGFPmRNA在200μLX-VIVO-15无血清培养基中的转染密度为2.5×109/L的DC,可获得较好的转染效果(转染效率达27%以上)。结论:在适当的条件下,通过mRNA转染DC可获得较高的转染效率。
- 仲飞仲振宇梁爽李秀锦
- 关键词：树突状细胞MRNAGFP基因转染
- 狐狸生长激素基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达被引量：1
- 2009年
- 为制备重组狐狸生长激素(fGH),采用RT-PCR方法,从银狐垂体中扩增fGHcDNA基因,利用SnaBI和NotI位点将fGH基因插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信号肽的下游,构建成fGH基因的酵母分泌型表达载体pPIC9K/fGH,载体经SalI酶切线性化后,通过电转移将线性化的pPIC9K/fGH转化到组氨酸缺陷型酵母宿主菌GS115中。然后利用不含氨基酸的以葡萄糖为碳源的培养基(MD)和以甲醇为碳源的培养基(MM)筛选出组氨酸His+型和甲醇利用正型(Mut+)酵母重组体,再经G418加压筛选出高拷贝fGH基因的重组酵母,经摇瓶发酵培养和甲醇诱导使fGH进行分泌表达。结果表明本实验扩增的fGH基因序列与GenBank发表的序列基本一致,发酵液经SDS-PAGE和Western blotting检测证明构建的重组酵母能够分泌表达fGH,表达的fGH占发酵液总蛋白的34%,表达量达119mg/L发酵液。
- 李巍李秀锦仲飞靳慧君解民刘玉芝刘龙飞苏清洁
- 关键词：CDNA毕赤酵母分泌表达
- 白细胞介素-12对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用被引量：6
- 2012年
- 犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平,本研究在小鼠体内尝试了利用白细胞介素12(IL-12)基因表达载体提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平。首先采用RT-PCR方法从小鼠脾淋巴细胞中分别扩增IL-12大亚基(P40)和小亚基(P35)cDNA基因;然后在真核表达载体pcDNA3.1A上通过引入内部核糖体进入位点(IRES)序列,分别将P40基因和P35基因插入到IRES序列的上下游,构建成IL-12(P40和P35双亚基)基因表达载体,pcDNA-P40-IRES-P35。将上述表达载体与本室构建的VP2表达载体通过磷酸钙方法转染HEK 293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达载体能否介导相应基因在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2载体单免疫和VP2载体和IL-12载体共免疫方法对小鼠进行免疫(用pcDNA3.1A作为对照)。免疫后在特定时间通过ELISA方法检测小鼠血清抗VP2蛋白的抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后35d小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果表明,扩增的小鼠IL-12P40和P35亚基基因与GenBank的参考序列基本一致。Western-blot检测结果表明,重组IL-12和VP2均能够在HEK293T细胞中进行分泌性表达。ELISA检测结果表明利用IL-2载体与VP2载体共免疫小鼠,其血清中抗VP2的抗体水平明显高于VP2载体单免疫组(P<0.01),抗体水平在第35天高达1:5120。淋巴细胞增殖试验结果表明,免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组(P<0.01),VP2载体与IL2载体共免疫组的刺激指数明显高于VP2载体单免疫组(P<0.05)。由此可见,在小鼠体内,IL-12基因表达载体可明显提高CPV VP2基因疫苗的免疫应答水平。
- 潘素敏李秀锦仲飞柳新保韩冬梅王幸兴潘宏丽王微
- 关键词：IL-12细小病毒VP2基因DNA疫苗
- 模拟微重力对NIH-3T3细胞clock及bmal1基因表达的影响被引量：1
- 2012年
- 目的探讨模拟微重力对NIH-3T3细胞节律基因clock与bmal1 mRNA表达的影响。方法 NIH-3T3细胞采用回转器分别回转培养6 h,12 h,18 h,24 h,30 h,36 h,42 h和48 h,同时设置1 G静置培养为对照组。Trizol试剂提取细胞总RNA,实时定量PCR法检测节律基因clock及bmal1 mRNA在各时间点的相对表达量。通过余弦法获取节律参数,并经振幅检验分析是否存在昼夜节律。结果 clock及bmal1基因mRNA的表达趋势相近。对照组clock与bmal1 mRNA相对水平呈现节律性表达,而回转组表达无节律性。回转组mRNA相对水平最大值出现于约6 h时间点,最小值出现在约18 h,而对照组分别出现于约18 h与24 h。与对照组比回转组的周期延长了约16 h。回转后clock与bmal1的峰值相位前移。结论 NIH-3T3细胞中clock与bmal1的表达存在同步化的转录特征。模拟微重力可影响clock与bmal1节律的周期长度及峰值相位。
- 王艳利吕柯钟悦江舟曲丽娜陈海龙毕蕾曹宏卿李秀锦李莹辉
- 关键词：模拟微重力近日节律CLOCK基因
- 基于膜受体阻断犬细小病毒感染的分子机制研究
- 仲飞李秀锦仲峰李文艳王微温洁霞潘素敏潘红丽李楠王幸兴韩冬梅王利月林洪羽张永红张建楼
- 基于细小病毒VP2蛋白与宿主细胞膜TfR特异结合并介导病毒感染的特性，利用宿主细胞的TfR细胞外区（也称可溶性的TfR，即sTfR）重组蛋白封闭细小病毒颗粒，从而达到阻止细小病毒感染宿主细胞的目的。在项目研究过程中，课题...
- 关键词：
- 关键词：细小病毒感染分子生物学
- 大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基K63突变体表达载体的构建及其在真核细胞中的表达被引量：1
- 2009年
- 采用PCR方法从产肠毒素大肠杆菌（ETEC）44815菌株基因组中扩增不耐热肠毒素A亚基（LTA）编码基因，并将大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因插入到含有人CD5信号肽序列的pcDNACD5sp真核表达载体中，构建成pcDNACD5sp／LTA分泌性真核表达载体，然后采用定点突变方法将大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基第63位的丝氨酸改变为赖氨酸，构建成pcDNACD5sp／LTAK63突变体，经磷酸钙介导将pcDNACD5sp／LTAK63质粒转染HEK293T细胞进行表达。结果表明：试验克隆的大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因与GenBank中大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因序列相比，碱基序列、氨基酸序列同源性均达99％；表达产物经Western-blot检测，结果说明构建的含有人CD5信号肽的LTAK63基因能够在真核细胞中进行分泌性表达。
- 韩冬梅李秀锦李楠王微李巍潘素敏仲飞
- 关键词：大肠杆菌基因克隆定点突变真核表达
- 重组单增李斯特菌溶血素O在大肠杆菌中的分泌表达及活性分析被引量：2
- 2014年
- 单增李斯特菌是食源性致病菌,常引起人和动物的生殖障碍,由此菌分泌的溶血素O(LLO)是重要的致病因子。为研究LLO对细胞的毒性作用及对动物体生殖免疫的调节作用,需要制备大量重组LLO。为此本试验依据LLO基因序列(JN703918)通过PCR方法从单增李斯特菌菌株基因组中扩增无信号肽的LLO编码基因,然后将其插入到pET-20b(+)质粒中,使其5′端与载体中的pelB信号肽序列融合,3′端与His-标签融合,构建成LLO分泌性原核表达载体pET-20b-LLO/H。将载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,在IPTG的诱导下进行表达,利用Ni-NTA琼脂糖凝胶从细菌周质释放液中提取和纯化重组LLO蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。利用溶血试验检测重组蛋白的生物活性。结果表明,本试验扩增的LLO基因序列与GenBank中的LLO基因序列完全一致。采用分泌性表达策略实现了重组LLO在大肠杆菌中的分泌表达,并且表达的重组LLO具有明显的溶血活性。
- 李文艳张永红林洪羽李秀锦仲飞
- 关键词：单增李斯特菌大肠杆菌分泌表达
- 人CD23基因的扩增及其在HEK 293T细胞的高效表达
- 2007年
- 目的建立一个有效表达CD23的系统。方法采用RT-PCR方法,从外周血淋巴细胞中扩增人的CD23cDNA基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3·1B上,构建成pcDNA3·1/CD23质粒表达载体;将pcDNA3·1/CD23质粒转染HEK293T细胞,通过流式细胞仪和Westernblot检测CD23在细胞中的表达情况。结果扩增的CD23cDNA序列与文献报道的一致;通过构建表达载体和转染细胞实现了CD23cDNA在293T细胞膜上的表达。转染效率达80%以上,并获得了较高水平的表达。结论扩增CD23cDNA基因,经过转染HEK293T细胞,实现了CD23在HEK293T细胞的高效表达。
- 李秀锦仲峰付志强范绍瑛李轶刘俊乐仲飞
- 关键词：CD23WESTERNBLOT流式细胞分析
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒与受体结合的研究进展
- PRRSV的宿主细胞是猪肺泡巨噬细胞(PAM),PAM细胞上的PRRSV受体有三个:硫酸乙酰肝素、噬液酸粘附索、CD163,共同介导病毒的侵染。Marc-145中发现的受体是波形蛋白受体(Vimenfin)。由于PRRS...
- 张永红林洪羽王利月李秀锦仲飞
- 关键词：PRRSV硫酸乙酰肝素
- 文献传递
