张中洋
- 作品数：19 被引量：40H指数：4
- 供职机构：北京生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划国家高技术研究发展计划“重大新药创制”科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人巨细胞病毒gB基因真核表达载体的构建与鉴定被引量：4
- 2004年
- 目的 克隆人巨细胞病毒 (HCMV)gB基因并构建真核表达载体。方法 根据Genebank中HCMV核苷酸序列设计引物 ,并在引物的 5′端分别加入BamHⅠ、XhoⅠ限制性内切酶位点 ,特异性扩增gB编码基因片段。TA克隆后经双酶切、PCR、测序等鉴定重组质粒 ,再经双酶切、连接构建含HCMVgB编码基因的真核表达载体 ,转染COS7细胞 ,通过间接免疫荧光法 (IFA)检测该重组真核表达载体在COS7细胞中的表达。结果 重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成大小为 5 0kb与 2 7kb的片段 ,表明表达载体pcDNA3 1中插入了HCMVgB基因片段 ,测序结果表明读码框正确。重组表达载体pcDNA3 1 gB转染COS7细胞后 ,经IFA检测胞浆中可见黄绿色荧光。结论成功构建了pcDNA3 1 gB真核表达载体 。
- 许丽锋张中洋李秀玲何薇薇
- 关键词：人巨细胞病毒GB基因真核表达载体重组质粒
- 不同方法配制的DTaP—sIPV中sIPV的免疫原性研究被引量：1
- 2017年
- 目的 对采用不同配制方式制备的，含不同剂量Sabin株脊髓灰质炎（脊灰）灭活疫苗（Sabin strain inactivated poliovirus vaccine，sIPV）的DTaP-sIPV联合疫苗中sIPV的免疫原性进行研究。 方法 按照2种不同方式配制含高、低剂量sIPV的DTaP-sIPV联合疫苗。将70只大鼠按简单随机法分成7组，分别为F1H（DTaP-sIPV高剂量组，配制方式1）、F2H（DTaP-sIPV高剂量组，配制方式2）、sIPV-H（sIPV高剂量组）、F1L（DTaP-sIPV低剂量组，配制方式1）、F2L（DTaP-sIPV低剂量组，配制方式2）、sIPV-L（sIPV低剂量组）、赛诺菲巴斯德五联疫苗潘太欣组。每组10只大鼠，间隔3周双侧后腿肌内注射，0.5 ml/只，共免疫3针。于第0、3、6、9、13、17、21、25周眼眶采血、分离血清，采用微量细胞病变效应抑制法分别测定血清中抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒中和抗体滴度，并进行多样本均数方差分析。结果 每针免疫后，各组抗各型中和抗体滴度均持续上升，第9周均达到最高水平，第13周开始显著下降，至第25周仍维持在一定水平。3针免疫完成后3周，F2H组的抗Ⅰ型脊灰病毒中和抗体几何平均滴度显著高于潘太欣组（F=0.988，P=0.027）；抗Ⅱ型中和抗体，F2H组显著高于F1H组，sIPV-H组显著高于F1H和潘太欣组（F=2.391，P值均〈0.05）；抗Ⅲ型中和抗体，各组间差异均无统计学意义。3针基础免疫后各时间点F2H组抗各型中和抗体滴度均为最高，但除第9周其抗Ⅱ型中和抗体显著高于F1H组外，其他差异均无统计学意义。结论 DTaP-sIPV联合疫苗免疫大鼠后可以诱导产生抗各型中和抗体，且其滴度和持续时间均优于或等同于潘太欣组。DTaP-sIPV诱导的中和抗体滴度不低于相应剂量的sIPV。虽然配制方式2可能更佳，但2种配制方式间sIPV的免疫原性差异无统计学意义。
- 张中洋宋冬梅鲁卫卫张越刘善茹胡业勤艾绪露李秀玲
- 关键词：脊髓灰质炎病毒疫苗免疫原性
- 水痘-带状疱疹病毒VZV84-7株全基因序列测定及分析被引量：4
- 2010年
- 目的分析我国自行分离的水痘-带状疱疹病毒疫苗株北京株(VZV84-7株)的全基因序列及特征。方法采用超速离心法获得纯化病毒颗粒,酚-氯仿法抽提病毒基因组DNA后超声破碎,回收1500～3000bp的片段,克隆至质粒pUC18中,构建病毒DNA文库,进行测序及序列分析,并与Dumas野毒株进行比较,绘制种系发育树,分析其与其他株VZV的同源性。结果VZV84-7株基因组全长125083bp,G+C含量为46.1%。基因组各区段长度及G+C含量分别为:UL:104746bp,G+C:44.3%;TRL和IRL:各89bp,G+C:69.7%;Us:5235bp,G+C:42.8%;TRS和IRS:各7462bp,G+C:59.3%。其R2可变区重复单位的拷贝数为7个,R4可变区为9个,R5可变区为1个。VZV84-7株共有71个ORFs,其中3个基因位于重复序列区,位于IRS的ORF69～71与位于TRS的ORF62～64序列完全一致。与Dumas株相比,共有248个核苷酸位置存在差异,大部分突变为单个核苷酸替换,另有部分插入或缺失性突变。其中碱基转换比碱基颠换更常见,发生率分别为66%和34%。种系发育分析结果显示,VZV84-7株与其他株VZV的同源性为95%以上。结论VZV84-7株具有其独特的基因特征,但与其他株VZV具有较高的同源性。
- 李秀玲王潇潇张中洋郝春生张晨何薇薇
- 关键词：水痘-带状疱疹病毒基因
- 抗脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原单克隆抗体的制备及其初步应用被引量：2
- 2012年
- 目的制备脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)Ⅰ型D抗原单克隆抗体,并建立双抗体夹心ELISA检测方法。方法采用Vero细胞培养脊髓灰质炎病毒Ⅰ型,柱层析纯化病毒抗原,SDS-PAGE鉴定病毒蛋白,HPLC分析抗原纯度,Western blot分析抗原的反应原性。以纯化的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原免疫BALB/c小鼠,进行细胞融合,筛选可分泌脊髓灰质炎病毒I型D抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单克隆抗体经纯化后,采用间接ELISA法检测小鼠腹水抗体效价、单抗的特异性及相对亲和力。分别以纯化的单抗作为捕获抗体和酶标抗体,进行配对试验,建立用于脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原检测的双抗体夹心ELISA方法,确定方法的最佳线性范围,并验证方法的特异性。结果纯化的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原经SDS-PAGE分析,共显示4条蛋白条带,相对分子质量分别为约40 000、35 000、32 000和28 000;经HLPC分析,纯度达99%;小鼠免疫血清可与相对分子质量约为35 000的VP1蛋白发生特异性反应。共筛选出5株可稳定分泌脊髓灰质炎病毒I型D抗原单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,纯化的单抗仅与D抗原发生反应;2H1和3B5株单抗的效价分别为2×107和2×106,且亲和力高于其他3株单抗。采用2H1和3B5株单抗配对,可以特异性检测D抗原,而与C抗原不反应;D抗原最佳线性范围为4.300～0.071 DU/ml,R2为0.994 6。该法仅可检出脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原,而与脊髓灰质炎病毒Ⅱ型、Ⅲ型D抗原和脊髓灰质炎病毒Ⅰ型C抗原、EV71抗原、Vero细胞培养上清不发生交叉反应。结论制备了脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原单克隆抗体,建立了可用于脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原特异性检测的双抗体夹心ELISA方法。
- 张中洋郭会杰赵敏杨永娟郝春生李懿马淑花刘宇宁海京张晨陈明田龙李秀玲
- 关键词：脊髓灰质炎病毒D抗原C抗原抗体单克隆酶联免疫吸附测定
- 人乳头瘤病毒16型L1/E7嵌合基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达
- 2006年
- 目的 克隆人乳头状瘤病毒16型（HPV16）L1／E7嵌合蛋白基因，并在毕赤酵母中表达。方法 PCR扩增HPV16L1／E7基因，并克隆至毕赤酵母表达载体pPIC-3．5K和pPIC-9K中，构建含HPV16L1／E7基因的pPIC3．5K—HPV16L1／E7和pPIC9K—HPV16L1／E7重组表达载体，经测序证实插入的外源基因读码框正确后，分别转入GS115和KM71菌株中，筛选阳性转化菌株，经PCR鉴定，甲醇诱导表达HPV16L1／E7嵌合蛋白，经SDS—PAGE和Western blot鉴定，电镜观察，并经离心法纯化VLPs。结果 HPV16LI／E7基因已成功插入pPIC-3．5K和pPIC-9K载体中，共获得6株KM71HPV16L1／E7-pPIC3．5K、5铢GS115HPV16L1／E7-pPIC3．5K、1株KM71HPV16L1／E7-pPIC9K和2株GS115HPV16L1／E7-pPIC9K阳性转化菌株，并可表达相对分子质量约为69000的蛋白，与预期值一致。表达量约为0．35～1．04mg／ml。Western blot显示该蛋白可与抗-HPV16L1蛋白和抗-HPV16E7蛋白的单克隆抗体特异性结合。在透射电镜下可观察到VLPs的形成，其形态与HPV16天然病毒颗粒相似。经纯化的目的蛋白纯度接近100％。结论 已成功构建了pPIC3．5K—HPV16L1／E7和pPIC9K—HPV16L1／E7重组表达载体，阳性转化菌株可表达结构与野生型HPV16一致的VLPs。
- 宋衍燕李秀玲何薇薇张中洋许丽锋
- 关键词：人乳头瘤病毒毕赤酵母基因表达
- 肠病毒71型(EV71)分离株的鉴定及免疫原性研究
- 本研究首先对采用Vero细胞从EV71感染流行地区患者体内分离到的病毒进行鉴定，电镜下可观察到直径约为20-30nm的圆形病毒颗粒，呈典型的肠道病毒形态;采用特异性EV71单抗进行间接免疫荧光试验检测，其可与EV71特异...
- 李秀玲张中洋王潇潇杨永娟郝春生赵敏何薇薇张晨沈心亮
- 关键词：免疫原性间接免疫荧光试验基因序列测定
- 文献传递
- Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗免疫原性研究被引量：2
- 2015年
- 目的:评价Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliomyelitis vaccine,s IPV)的免疫原性。方法:将130只大鼠随机分成13组,分别为无佐剂s IPV原倍(Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型抗原含量为:10 DU/50 DU/30 DU)、3倍、9倍、27倍稀释抗原剂量组、含佐剂s IPV原倍(Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型抗原含量为:10 DU/50 DU/30 DU)、3倍、9倍、27倍稀释抗原剂量组、野毒株脊髓灰质炎灭活疫苗(Conventional inactivated poliomyelitis vaccine,c IPV)原倍(Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型抗原含量为:40 DU/8 DU/32 DU)、3倍、9倍、27倍稀释抗原剂量组和阴性对照组。每组10只,腿部肌内注射,0.5 m L·只-1,免疫两剂,免疫间隔时间为21 d。免疫前、第1剂免疫后21 d眼眶采血、第2剂免疫后21 d心脏穿刺采血,分离血清,采用微量细胞病变抑制法测定血清中抗脊髓灰质炎病毒Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型中和抗体效价,计算无佐剂s IPV和含佐剂s IPV ED50值、并与c IPV进行比较。结果:免疫1剂后,无佐剂s IPV、含佐剂s IPV和c IPV组Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型在不同稀释度时,除含佐剂s IPVⅠ型均为100%阳转率,其他几组均随着抗原稀释度的增加中和抗体的阳转率梯度下降。Ⅰ型无佐剂、含佐剂s IPV ED50分别是c IPV的0.02,0.004倍;Ⅱ型无佐剂、含佐剂s IPV ED50分别是c IPV的26.83,5.55倍;Ⅲ型无佐剂、含佐剂s IPV分别是c IPV的0.24,0.13倍。Ⅰ型含佐剂s IPV组1剂免疫后各剂量组大鼠血清中和抗体显著高于无佐剂s IPV相应剂量组(P<0.05),免疫两剂后,略高于无佐剂组,但没有统计学差异。Ⅱ型含佐剂s IPV各剂量组1剂免疫后大鼠血清中和抗体略高于无佐剂相应剂量组,但仅16.7 DU组存在统计学差异(P<0.05),免疫两剂后,仅50 DU组明显高于无佐剂组(P<0.05)。Ⅲ型含佐剂s IPV各剂量组1剂免疫后大鼠血清中和抗体略高于无佐剂相应剂量组,但均无统计学差异;免疫两剂后,30 DU组和1.1 DU组明显高于相应剂量组(P<0.05)。结论:s IPV免疫原性较好,其中Ⅰ型免疫�
- 宋冬梅张中洋鲁卫卫温智恒郭会杰张越李秀玲
- 关键词：中和抗体免疫原性
- 肠病毒71型空斑检测方法的建立被引量：4
- 2009年
- 目的建立肠病毒71型(EV71)空斑检测方法,为EV71生物学特性及疫苗的研究提供手段。方法将不同稀释度的5株EV71分别接种至单层RD细胞和Vero细胞,加入甲基纤维素覆盖,计数空斑,并计算病毒滴度。通过3次连续检测,验证空斑法的精密性,并对空斑法与微量细胞病变法检测病毒滴度的结果进行比较。结果采用RD细胞和Vero细胞,通过空斑法对EV71病毒滴度进行检测,96h后均能规律地出现边缘整齐、清晰的空斑,RD细胞和Vero细胞检测的空斑直径分别为1～2mm和0.5～1mm。连续3次重复试验结果显示,试验间变异系数的平均值Vero细胞为2.52%,RD细胞为4.49%。空斑法与微量细胞病变法比较,其检测结果具有良好的线性相关性,相关系数为r=0.972,P=0.006。结论已建立了精密性好、出斑规律的EV71病毒空斑检测方法。
- 郝春生赵敏张晨何薇薇王潇潇杨永娟张中洋沈心亮李秀玲
- 关键词：肠病毒71型
- 我国水痘-带状疱疹病毒VZV84-7减毒株基因特征研究
- 目的:建立特异性鉴定水痘-带状疱疹病毒(VZV)毒株的方法,研究我国自行分离的VZV84-7减毒株(VZV84-7株)基因特征.方法:利用聚合酶链反应(PCR)技术分别扩增VZV84-7株和Oka株R2和R5可变区基因,...
- 李秀玲谢云何薇薇张中洋庞宇刘立新
- 关键词：水痘-带状疱疹病毒基因聚合酶链反应克隆
- 文献传递
- 建立膜抗原荧光抗体试验评价北京株冻干水痘疫苗免疫效果被引量：7
- 2005年
- 为了建立用于水痘疫苗接种后血清中特异性抗体检测的膜抗原荧光抗体(FAMA)法,并对接种水痘疫苗后儿童血清中水痘特异性抗体进行检测,评价北京株水痘疫苗的免疫效果。以水痘带状疱疹病毒(VZV)感染细胞作为抗原制备成固定抗原玻片,以异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗人IgG作为二抗建立FAMA法,并对该法的敏感性、特异性进行验证。运用此法对不同剂量北京株水痘疫苗接种后儿童血清中特异性抗体进行检测,分析儿童血清中水痘特异性抗体水平以及免后抗体阳转率,并与Oka株水痘疫苗进行比较。结果显示,FAMA法敏感性可达0.0196IU/ml,特异性好。应用此法检测300名观察者免前免后双份血清样本中抗VZVIgG,易感者中北京株水痘疫苗原苗(39810PFU/0.5ml)、2000PFU/0.5ml、500PFU/0.5ml接种组儿童血清免后抗体阳转率分别为100%、98.77%、85.42%,抗体几何平均滴度(GMT)分别为36.4、34.3、18.6,原苗与2000PFU间的抗体阳转率和GMT均无显著性差异(P>0.05),但原苗与500PFU、2000PFU与500PFU间的抗体阳转率和GMT均有显著性差异(P<0.05)。对照国产、进口Oka株水痘疫苗接种后抗体阳转率分别为95.35%、96.97%,抗体GMT分别为13.3、16.0,不同剂量北京株疫苗抗体阳转率与国产、进口Oka株疫苗相比,差别无显著性(P>0.05),但北京株疫苗原?
- 谢云李秀玲刘立新何薇薇张中洋张晨宋衍燕陈海平周铁群
- 关键词：水痘疫苗免疫效果
