周生来
- 作品数：35 被引量：52H指数：5
- 供职机构：中国医科大学实验动物部更多>>
- 发文基金：辽宁省科学技术计划项目辽宁省科学技术基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学化学工程更多>>
- 5-脂氧化酶转基因小鼠表型初步研究
- 2015年
- 目的建立5-脂氧化酶（5-LO）高表达转基因小鼠模型，为动脉粥样硬化（AS）发病分子机制的研究提供有应用价值的动物模型。方法对5-LO转基因及正常对照小鼠分别选用RT—PCR、免疫组织化学、血脂、血压监测等方法进行分析实验。结果5-LO及大鼠5-脂氧合酶激活蛋白（FLAP）免疫组织化学实验结果显示，在肾和肺中5-LO及FLAP的表达，转基因小鼠高于正常对照组小鼠：RT—PCR实验结果显示，转基因小鼠与正常对照小鼠比较在骨髓细胞、腹腔细胞、脾脏、肾脏中白三烯介质及其受体均有不同程度的高表达。其中，两种小鼠的腹腔细胞和骨髓细胞中白三烯A4（LTA4）、白三烯B4（LTB4）和半胱酰胺-白三烯受体2（Cys—LTR2）的表达存在差异（P〈0．05），脾和肾脏中LTB4、白三烯C4（LTC4）及Cys—LTR2的表达存在差异（P〈0．05），肾脏中半胱酰胺-白三烯受体1（Cys-LTR1）的表达存在差异（P〈0．05）。C反应蛋白（CRP）、白介素-1β（IL-1β）、血小板衍生因子（PDGF）、坏死因子-κB（NF-κB）等细胞因子检测结果显示，在肾组织中转基因小鼠的各项指标显著高于正常对照小鼠（P〈0．05）；血压测定结果显示，转基因小鼠高于正常对照小鼠（P〈0．05）；血脂检测结果显示，两种小鼠未见明显差异（P〉0．05）。结论成功建立5-LO高表达转基因小鼠模型。
- 张梅英杨葳吴红联董婉维周生来于洋王惟郭晓冲郑志红
- 关键词：转基因小鼠
- eNOS基因敲除大鼠模型的建立及表型初步研究
- 2015年
- 目的建立内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因敲除大鼠模型。方法利用锌指核酸酶（ZFN）技术，通过显微注射的方法将编码eNOS特异性锌指酶的mRNA注入SD大鼠受精卵并移植到同期受孕的SD受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR产物测序的方法鉴定基因型。对敲除大鼠进行外观观察，HE染色分析组织结构形态。通过Westernblot分析敲除大鼠模型的心脏和肾脏组织中eNOS的表达情况。测量8～16周大鼠体质量，分析eNOS基因敲除对体质量的影响。采用尾套法测量大鼠心率、血压、收缩压和舒张压，比较与野生型大鼠的差异。结果通过显微注射方法共注射441枚受精卵，存活365枚，分别移入12只SD大鼠输卵管，共产出23只F0代大鼠。PCR产物测序分析获得4只阳性原代大鼠，对8号大鼠筛选获得纯合子。阳性纯合子大鼠表现为肢体缺损，HE染色显示动脉血管结构形态异常。Westernblot结果显示，eNOS敲除大鼠的心脏和肾脏组织中不表达eNOS蛋白。敲除大鼠的体质量明显低于野生型大鼠，体质量增长幅度慢。血压、收缩压、舒张压均高于野生型SD大鼠，有极显著差异（P〈0．01）。eNOS敲除雌鼠心率低于野生型SD雌鼠（P〈0．05）。eNOS敲除雄鼠心率与野生型SD雄鼠相比无统计学差异。结论成功建立eNOS基因敲除大鼠模型，该模型或可成为高血压疾病研究的理想动物模型。
- 杨葳周生来董婉维王惟于洋郭晓冲张婀娜王宏宇郑志红
- 关键词：基因敲除高血压
- 应用Talen法制备apoE基因敲除大鼠模型
- 2015年
- 目的应用转录激活因子样效应因子核酸酶（Talen）法制备载脂蛋白E（apoE）基因敲除大鼠模型，为进一步研究apoE基因功能，动脉粥样硬化（AS）疾病发病机制及治疗方法奠定基础。方法设计并合成针对大鼠apoE基因的Talen序列，应用原核显微注射方法制备子代鼠。通过PCR．测序及TA克隆-测序法检测仔鼠中apoE的突变，经传代及兄妹交配获得纯合型仔鼠，并对其基因型进行鉴定。应用Westemblot方法检测apoE-/-仔鼠各组织中ApoE蛋白表达水平；血清学分析血脂总胆固醇（CHO）及甘油三酯（TG）含量；应用RT—PCR方法检测脂质代谢相关基因三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）的表达。结果经鉴定选取在第二外显子处缺失1bp，造成开放阅读框移码突变的大鼠为阳性F0代仔鼠，该鼠经传代及筛选，最终获得apoE-/-大鼠。Westernblot检测显示apoE-/-鼠在心、肝、肾、脑、卵巢组织中未见ApoE蛋白的表达，表明在该模型中成功实现了apoE基因的敲除。apoE-/-鼠血脂CHO、TG均高于野生SD大鼠，其中CHO水平呈现显著性差异（P〈0．05）。在apoE-/-鼠肝组织中ABCA1的表达降低，可能起到促进AS形成的作用。结论应用Talen法成功制备apoE基因敲除SD大鼠；经筛选获得了纯合型apoE-/-大鼠，该模型实现了apoE基因敲除，并表现为高血脂及As性状。
- 徐影琪李晓晶杨葳周生来于洋王惟张婀娜赵文张梅英郭大勇王宏宇郑志红
- 金黄仓鼠Apoa5基因表达载体的构建及在不同组织器官中的差异表达
- 2015年
- 目的构建金黄仑鼠载脂蛋白A5（Apoa5）基因表达载体以及在不同组织中的表达差异分析，为深入研究Apoa5基因在金黄仓鼠不同组织中功能奠定基础。方法提取金黄仓鼠肝脏组织总RNA，采用RT—PCR方法对金黄仓鼠Apoa5基因的cDNA进行克隆，构建Apoa5基因表达载体并将其转染293T细胞，分别采用RT—PCR和Westernblot方法检测mRNA及蛋白质表达水平。采用荧光定量PCR检测并分析Apoa5mRNA在8个组织中的表达量。结果经PCR检测鉴定，Apoa5基因表达载体构建成功，经测序分析金黄仓鼠Apoa5基因cDNA全长1243bp，编码366个氨基酸，与人、大鼠、小鼠等物种比对，核苷酸和氨基酸序列均具有较高的同源性，金黄仓鼠与人、大鼠、小鼠的氨基酸同源性分别为75％、84％、84％。转染293T细胞48h后，RT—PCR和Westernblot结果表明，Apoa5基因在mRNA和蛋白质水平都有表达。荧光定量PCR结果显示，Apoa5mRNA在肝脏表达量最高，在脑和睾丸中中度表达，在心、脾脏、肺、肾、卵巢组织中低度表达。结论成功构建Apoa5基因表达载体并分析其在不同组织中的表达差异，为制备Apoa5转基因金黄仓鼠动物模型以及研究Apoa5基因在金黄仓鼠脂类代谢中的功能奠定基础。
- 董婉维张婀娜郭晓冲魏政立杨葳周生来赵文郑志红
- 关键词：金黄仓鼠基因表达
- 体外受精技术在大鼠胚胎冷冻保种中的应用
- 2015年
- 目的探讨大鼠体外受精（IVF）技术在大鼠胚胎冷冻应用的可行性。方法选用IVF-20溶液作为大鼠精子获能和受精培养液，改良大鼠1-细胞胚胎培养液（mR1ECM）作为受精卵培养液，对SD大鼠进行1VF，以输卵管灌流获得的2-细胞胚胎作为对照，并对发育良好的2-细胞胚胎实施胚胎冷冻，1周后复苏并对存活胚胎采用输卵管移植。结果采用灌流和IVF的方式分别获得胚胎463枚和588枚，2．细胞胚胎301枚（65．01％）和376枚（63．94％），二者受精率相比无显著性差异（P〉0．05）：采用两种方式获得的胚胎各冻存150枚，复苏后形态正常胚胎分别为132枚（88．00％）和130枚（86．66％），二者复苏率比较无显著性差异（P〉0．05）；对存活的胚胎各移植5只受体，分别产仔45只和22只，二者的产仔率（32．14％vs16．92％）有显著性差异（P〈0．05）。结论SD大鼠体外IVF技术在胚胎冷冻保种中应用是可行的，将为以后基因工程SD大鼠的胚胎冷冻保种提供技术支持。
- 周生来王维于洋杨葳张梅英郑志红
- 关键词：超排卵胚胎冷冻
- 大／小鼠组织DNA两种提取方法的比较被引量：1
- 2015年
- 目的获取质量稳定的基因组DNA，快速鉴定模型动物基因型。方法以鼠尾组织为实验材料，采用苯酚／氯仿法和改良煮沸法提取鼠基因组DNA；分别用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，采用PCR检测两种方法获得DNA的扩增效果。结果酚／氯仿提取法提取的基因组DNA质量优于改良煮沸法，但两种方法获得的DNA模板均能成功应用PCR扩增进行基因型鉴定，且改良煮沸法DNA提取具有无毒、简单、高效、便捷的优点。结论大批量转基因大／小鼠基因型鉴定可以优先选择改良煮沸法提取基因组DNA。
- 陈雪婷郎雪楠李兆阳张婀娜赵文董婉维周生来张梅英郑志红
- 关键词：DNA提取PCR基因型鉴定
- SD大鼠超数排卵的优化被引量：1
- 2015年
- 目的通过对鼠龄及激素剂量的控制研究其对SD大鼠排卵的影响。方法分别采用三种不同剂量PMSG／hCG组合（PMSG／hCG：20IU／20IU、25IU／25IU、30IU／30IU）对4、5、6周龄的SD大鼠进行超数排卵处理，以超数排卵总卵数、正常受精卵数、异型卵数作为评判标准，确定最佳超排剂量及鼠龄。结果20IU剂量时，三种周龄大鼠分别获取胚胎24．72枚、33．12枚、15．22枚，其中正常受精卵：21．58枚、29．1枚、13．1枚，异型卵：2．01枚、1．01枚、2．12枚；25IU剂量时，三种周龄大鼠分别获取胚胎37．63枚、43．62枚、20．78枚，其中正常受精卵22．67枚、38．6枚、18．5枚，异型卵：2．82枚、1．23枚、2．28枚；30IU剂量时，三种周龄大鼠分别获取胚胎51．69枚、61．36枚、30．2枚，其中正常受精卵47．2枚、60．8枚、25．6枚，异型卵：1．23枚、0．56枚、1．3枚。结论5周龄，激素剂量30Iu为大鼠超排的最适周龄及最佳激素剂量，为基因工程动物制备及胚胎冷冻实验提供技术保障。
- 张婀娜郎雪楠赵文陈雪婷董婉维周生来于洋王惟张梅英郑志红
- 关键词：超数排卵激素周龄SD大鼠
- 突变DJ-1转基因小鼠模型的建立被引量：3
- 2009年
- 目的探讨DJ-1L166P突变基因在帕金森病发生中的作用。方法构建pcDNA3.1-myc-his-DJ-1L166P真核表达载体,利用显微注射方法将DJ-1L166P基因片段(约3.9kb)导入BDF1小鼠受精卵雄原核并移植到同期受孕的ICR假孕母鼠输卵管中,对产出仔鼠的鼠尾组织DNA进行聚合酶链反应和Southern blot检测,对Southern blot鉴定阳性的转基因小鼠进行逆转录聚合酶链反应和Western blot检测。结果共产生20只子代小鼠,1号和7号为DJ-1L166P转基因阳性小鼠。1号转基因小鼠大脑、小脑、肝、肺、肾、睾丸有不同程度的DJ-1mRNA表达,均高于正常对照小鼠,但只有大脑中DJ-1mRNA的表达水平显著高于正常对照小鼠(P<0.05);7号转基因小鼠只有肝、肺组织中有DJ-1mRNA表达,也高于正常对照小鼠,但差异无统计学意义。只有1号小鼠大脑有His标签蛋白的表达。结论成功获得1只DJ-1L166P基因突变转基因小鼠模型,为课题的下一步实验研究打下良好的基础。
- 张梅英吴红联蔺美娜李兆阳周生来于洋王惟吕相川王禄增
- 关键词：DJ-1基因帕金森症转基因小鼠
- 大鼠显微注射胚胎采集方法的比较
- 2008年
- 目的优化大鼠显微注射前胚胎采集的方法。方法选用最佳超排5周龄SD大鼠,腹腔注射PMSG-HCG,分别用撕开输卵管壶腹部和输卵管伞端冲洗两种方法采集胚胎,比较获得卵数,受精率,注射存活率等的差异。结果冲洗输卵管伞端采集胚胎的方法所得到的受精率、存活率都较高,与撕开输卵管壶腹部方法比较差异显著(P<0.01),胚胎总数无显著性差异(P>0.05)。结论冲洗输卵管伞端采集胚胎的方法为大鼠显微注射前胚胎采集比较好的方法。
- 于洋周生来王惟吕向川张梅英王禄增郑志红
- 关键词：显微注射胚胎采集
- 潮霉素抗性转基因BDF1小鼠模型的建立被引量：1
- 2007年
- 目的建立具有潮霉素(hygromycin)抗性转基因BDF1小鼠,用于制备携有hygromycin抗性筛选标志ES阳性细胞克隆的饲养层。方法通过显微注射的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因片段(5.1kb)导入BDF1受精卵雄原核中,共注射169枚受精卵,然后将129枚受精卵细胞植入同期受孕的受体母鼠输卵管内。结果共产生37只转基因小鼠,经PCR和Southern检测获得9只阳性小鼠,对一只子代鼠进行RT-PCR检测证明hyg基因已经在肾、肌肉、脾内表达。结论成功的建立具有潮霉素抗性的BDF1转基因鼠,该模型动物可以为基因敲除研究提供良好的基础条件。
- 张梅英董婉维汪瑛杨葳李兆阳周生来于洋王惟秦英郑志红王禄增
- 关键词：潮霉素饲养层转基因
