陶建军
- 作品数：7 被引量：12H指数：1
- 供职机构：复旦大学更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项广东省科技计划工业攻关项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- hK-Fc融合蛋白的改良、表达及其生物活性的分析被引量：1
- 2009年
- 为了延长人激肽释放酶(hK)的血清半衰期,提高分泌蛋白的产率,制备了重组激肽释放酶-IgG1 Fc融合蛋白(hK'-Fc)。采用PCR扩增hK基因和IgG1的Fc序列,用鼠源信号肽序列替换hK基因原有的信号肽序列,构建改良型融合蛋白hK'-Fc以及天然型融合蛋白hK-Fc的表达载体,转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞,筛选稳定分泌融合蛋白的细胞株,通过Western blotting鉴定信号肽改造效果,利用Protein A+G亲合层析柱纯化融合蛋白,酶学实验检测融合蛋白的体外活性。结果表明:成功构建了pcDNA-hK'-Fc以及pcDNA-hK-Fc重组表达载体;获得了稳定表达融合蛋白的细胞株,产量达11mg/L以上;信号肽改造后融合蛋白的分泌效率提高约5～10倍;融合蛋白能水解其特异性的底物S-2266,具有生物学活性。本研究为进一步探讨融合蛋白的体内半衰期打下了坚实基础,也为研制治疗脑梗塞疗效更好的第二代hK蛋白和其他药用蛋白的改良提供新的线索。
- 周同陶建军李林国侯永敏余龙
- 关键词：激肽释放酶酶活性
- 一种人源溶菌酶蛋白纯化方法
- 本发明属于蛋白纯化领域，具体而言，本发明涉及一种纯化人源溶菌酶蛋白的方法。本发明还涉及该生产方法的应用。本发明提供了一种人源溶菌酶蛋白纯化方法，该人源溶菌酶蛋白纯化方法包括：发酵液的前处理；Bestarose MMC D...
- 江松敏余龙余文博于颖曹立环陶建军唐丽莎杨鲜梅赛音
- 文献传递
- 人LYC5溶菌酶基因在毕赤酵母中的重组表达被引量：1
- 2014年
- LYC5是一种c型人溶菌酶蛋白。根据毕赤酵母密码子的偏爱性,对LYC5的mRNA编码序列进行优化设计,将优化后的基因序列克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重组酵母表达质粒pPIC9K-LYC5。重组质粒经线性化处理后转化毕赤酵母GS115,应用G418抗性筛选出高拷贝转化子,并对其进行摇瓶诱导表达,产物经SDS-PAGE电泳检测,发现在约15 kDa的位置出现了一条特异蛋白条带,此条带经LTQ Orbitra pelite MS鉴定,证明此蛋白即LYC5溶菌酶蛋白,表达量约为20 mg/L。对表达上清液进行活性分析,发现表达上清对溶壁微球菌具有较好的溶菌活性,活性约为40 000 U/mg,最适酶活反应温度为45℃,最适pH为5.0。采用基因工程方法,首次表达出了有生物学活性的人源LYC5溶菌酶蛋白,为深入探讨人溶菌酶家族成员的抗菌谱及其应用前景的研究奠定了基础。
- 卫田田于颖金晓锋陶建军余龙
- 关键词：人溶菌酶毕赤酵母PPIC9K
- 一种人源溶菌酶蛋白发酵方法
- 本发明属于基因工程和发酵工程领域，提供了一种人源溶菌酶蛋白发酵方法，将表达人源溶菌酶的种子发酵液加入发酵罐进行高密度发酵；所述的高细胞密度发酵包括甲醇诱导、添加胰蛋白胨和甘油补料；发酵罐高密度发酵采用BSM发酵培养基，接...
- 江松敏余龙余文博于颖曹立环陶建军唐丽莎杨鲜梅赛音
- 文献传递
- 人源溶菌酶基因LYZL4在毕赤酵母中的重组表达及活性测定被引量：9
- 2014年
- LYZL4是本实验室克隆的一种c型人溶菌酶基因,根据毕赤酵母密码子偏爱性对LYZL4基因进行优化设计,优化后的基因克隆至具有乙醇氧化酶启动子(AOX1)的pPIC9K载体中。通过电转化方法整合到甲醇营养型毕赤酵母表达菌株GS115基因组上,再利用不同浓度梯度的G418抗性YPD固体培养基筛选高拷贝转化子,经摇瓶发酵后,其上清液在SDS-PAGE胶上14.4 kDa处出现明显的蛋白条带,该蛋白条带经质谱鉴定证实是人LYZL4蛋白。以人溶菌酶(164 071U/mg)作为标准品,使用艳红微球菌作为底物,通过比色法测定重组LYZL4溶菌酶蛋白的活性,结果显示重组人溶菌酶LYZL4蛋白具有明显的溶菌活性,其酶活力可达38893U/ml。
- 李新新陶建军余龙
- 关键词：毕赤酵母
- 一种人源溶菌酶蛋白纯化方法
- 本发明属于蛋白纯化领域，具体而言，本发明涉及一种纯化人源溶菌酶蛋白的方法。本发明还涉及该生产方法的应用。本发明提供了一种人源溶菌酶蛋白纯化方法，该人源溶菌酶蛋白纯化方法包括：发酵液的前处理；Bestarose？MMC？D...
- 江松敏余龙余文博于颖曹立环陶建军唐丽莎杨鲜梅赛音
- 文献传递
- hK1-L-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达及其活性研究被引量：1
- 2011年
- 为进一步改造重组人激肽释放酶1(hK1),以期提高其生物活性,制备了通过柔性接头相连接的重组人激肽释放酶1-L-IgG1 Fc融合蛋白(hK1-L-Fc)。采用重叠延伸PCR技术构建hK1-L-Fc融合基因,克隆至表达载体pcDNA3.1,在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-S)中表达。利用Protein A亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE、Western blotting、飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、HPLC检测表达产物,底物法检测融合蛋白的体外活性。结果显示:成功构建pcDNA3.1-hK1-L-Fc重组表达载体;获得稳定表达融合蛋白的细胞株;无血清悬浮批式培养的表达量在0.7 mg/L以上;纯化的蛋白其纯度在95%以上,分子量约60 kDa;活性检测显示其比活性在9.2 U/mg以上,较hK1-Fc蛋白提高了18%以上。
- 邓春平陶建军侯永敏钟翎
- 关键词：融合蛋白CHO细胞
