陆月
- 作品数：4 被引量：27H指数：2
- 供职机构：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室更多>>
- 发文基金：病毒基因工程国家重点实验室开放课题基金浙江省重大科技专项基金浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 基于λ-Red重组酶系统的Ⅳa2基因缺失及重组腺病毒的包装
- 2011年
- 本研究用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法缺失腺病毒基因组上Ⅳa2基因的大部分编码序列(1104 bp),并获得一种Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒。首先构建PCR打靶的含有卡那霉素抗性表达盒的模板质粒pAK,再以pAK为模板扩增出两端含39 bp同源臂的线性DNA片段;将pFG140质粒及线性DNA片段依次转化到宿主菌BW25113/pIJ790中,通过λ-Red重组酶介导的同源重组获得了缺失Ⅳa2基因的腺病毒基因组质粒pFG140-ΔⅣa2(1104)。酶切及DNA测序结果显示,用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法在pFG140上精确地缺失了预计的Ⅳa2基因3'端的1104bp片段。用PCR方法扩增获得Ⅳa2基因全长ORF,插入表达载体pAAV2neo中,构建成Ⅳa2基因表达质粒pAAV2neo-Ⅳa2。将pFG140-ΔⅣa2(1104)与pAAV2neo-Ⅳa2共转染HEK293细胞,成功地获得了重组腺病毒Ad5ΔⅣa2(1104)。Western Blot的结果表明,Ad5ΔⅣa2(1104)病毒感染的HEK293细胞检测不到Ⅳa2蛋白的表达。本研究建立了一种对腺病毒基因组直接进行缺失操作的λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法,并获得了一种IVa2基因大部分缺失的重组腺病毒。
- 柳云帆尉迟捷王刚田文洪陆月刘雪荣董小岩郑刚沈炜吴小兵阮力
- 关键词：腺病毒
- 腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRII-gAD快速表达和制备
- sTNFRII-gAD融合蛋白是一种双功能蛋白质分子,sTNFRII可以与TNFα结合,减轻炎症的发生,达到治疗类风湿性关节炎等疾病的目的.已经上市的TNFα拮抗药物sTNFRII-Fc是二聚体形式的sTNFRII.但T...
- 陆月刘丹刘雪荣沈炜郑刚柳云帆董小岩吴小兵高基民
- 关键词：腺病毒重组蛋白哺乳动物细胞
- 高嗜肝性8型重组腺相关病毒体内转导法制备乙型肝炎病毒持续感染小鼠模型被引量：24
- 2010年
- 用高嗜肝性的重组8型腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus type8,rAAV8)载体携带1.3拷贝乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)基因组(ayw亚型)体内转导法,建立持续表达HBV抗原的C57BL/6小鼠模型。首先,制备并纯化了携带1.3拷贝HBV基因组(ayw亚型)的重组8型腺相关病毒(rAAV8-1.3HBV);将rAAV8-1.3HBV以剂量2×10e11vg/只注射C57BL/6小鼠(Viralgenome,vg);在不同时间点实施尾静脉采血,采用ELISA方法监测血清中HBsAg和HBeAg的水平及动力学变化;10周后处死小鼠,取血液、肝组织样本,提取基因组DNA,荧光定量PCR检测HBVDNA拷贝数;利用鉴定HBVDNA环化形式的特异性引物进行PCR扩增以检测肝组织中环化的HBVDNA,并检测HBV抗原特异性的免疫组化和肝脏病理变化。结果显示,注射rAAV8-1.3HBV的3只C57BL/6小鼠第1周开始在血液中检测到HBsAg和HBeAg的表达,并持续至第10周均为阳性,其中HBsAg的表达水平经历了一个上升-下降-再上升的过程(注射后第4周时最低,第6周后维持较高水平),而HBeAg表达水平则持续阳性且比较稳定。荧光定量PCR结果显示,3只小鼠10周后血清中HBV DNA的拷贝数分别为4.2×103、3.6×103、2.5×103copies/mL,肝脏中则分别为8.0×106、5.7×106、2.6×106copies/g肝组织。在3只小鼠肝组织中均检测到环化HBV DNA,提示AAV8载体携带的线性HBV DNA成功回复成环化HB VDNA。免疫组化分析显示3只小鼠肝脏中均存在HBsAg和HBcAg表达;体内转染10周后肝脏组织切片的HE染色分析显示未见明显的炎性细胞浸润及组织结构异常。结果表明,本研究利用高嗜肝性重组8型腺相关病毒载体携带1.3拷贝乙型肝炎病毒基因组(ayw亚型)体内转导C57BL/6小鼠,成功地建立了HBV病毒在肝内稳定复制并持续表达HBV抗原的小鼠模型,为进一步研究HBV慢性持续感染的机制与应用于药物以及疫苗评价打下了基础。
- 董小岩尉迟捷王刚田文洪陆月张风卫王文王岳谭文杰吴小兵
- 关键词：乙型肝炎病毒
- 腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRII-gAD快速表达和制备被引量：3
- 2011年
- 利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性,建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法,并用该方法获得sTNFRII-gAD（可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白）蛋白纯品。首先用携带EGFP基因的腺病毒载体rAd5-EGFP以不同的腺病毒用量（MOI）（0-1 000）感染BHK21c022细胞,观察比较其转导效率和细胞毒性。用AdMax腺病毒载体系统制备携带融合基因sTNFRII-gAD的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD。用rAd5-sTNFRII-gAD以不同的MOI（0~1 000）感染BHK21c022细胞,收取上清进行Western blotting分析,比较上清中sTNFRII-gAD蛋白的表达量。在此基础上,用rAd5-sTNFRII-gAD以MOI 100感染大量培养的BHK21c022细胞,在无血清培养条件下反复多次收取培养上清,经过硫酸铵浓缩、分子筛柱层析、透析等步骤浓缩和纯化sTNFRII-gAD融合蛋白,并体外测定该融合蛋白拮抗TNFα的活性。结果获得了携带sTNFRII-gAD融合基因的重组腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD;用rAd5-EGFP感染BHK21c022细胞结果表明,随着腺病毒用量的增高,表达EGFP蛋白的BHK21c022细胞数量和亮度明显增加;MOI在0~100之间被感染的BHK21c022细胞未表现出明显的细胞毒性,MOI为1 000时可观察到细胞变圆和少量死亡现象。Western blotting分析结果表明,随着腺病毒用量的增高,培养上清中sTNFRII-gAD融合蛋白表达量明显增加,以MOI为1 000时最高。在此基础上,我们用MOI为100的rAd5-sTNFRII-gAD感染5个转瓶培养的BHK21c022细胞以制备sTNFRII-gAD融合蛋白。每个转瓶加无血清培养液100 mL,每48 h收获上清1次并换液,反复6次收取培养上清共约3 L,经过纯化获得了约11 mg的sTNFRII-gAD融合蛋白。体外活性测定实验表明,获得的sTNFRII-gAD融合蛋白能有效拮抗TNFα对L929细胞的杀伤作用。腺病毒载体/BHK21细胞表达系统是一个简便、高效、通用的表达系统,利用该系统成功制备了有生物学�
- 陆月刘丹张孝任刘雪荣沈炜郑刚柳云帆董小岩吴小兵高基民
- 关键词：腺病毒重组蛋白哺乳动物细胞
