李明辉
- 作品数：6 被引量：21H指数：3
- 供职机构：同济大学医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- C端甲状旁腺相关肽的克隆及其对骨骺干细胞的调控作用被引量：2
- 2009年
- 目的探讨C端甲状旁腺相关肽（PTHrp107-139）对体外培养的骨骺干细胞的调控作用以及与其他调控因子的关系。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法克隆大鼠PTHrp全长中的107～139片段，并将其亚克隆至质粒pTRE2hyg上，构建新的质粒pTRE2hyg—PTHrp107-139，并将其与质粒pTet—on共转染分离纯化的骨骺干细胞，放入含有维生素c和地塞米松的全培养基中进行培养，分别加入0．1、0．5、2．0mg／L的强力霉素（Doxycycline）进行诱导，并设置空白对照。48～72h后抽提各组细胞的RNA进行逆转录，然后通过半定量PCR的方法检测增殖细胞核抗原（PCNA、SOX9等基因的表达变化，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果加入DOX组的PCNA、ColⅡ、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、SOX9表达增加，骨骺干细胞数量明显增多，而Ptc、ColX、骨形态发生蛋白（BMP）-6表达减少。结论C端甲状旁腺相关肽可能有促进骨骺干细胞增殖并抑制其分化的作用，但对细胞凋亡无明显影响。
- 李明辉郭风劲张树威宋登新王江易磊
- 关键词：甲状旁腺骨骺干细胞软骨形成
- 低分子量肝素对骨肉瘤细胞增殖和survivin表达的影响被引量：3
- 2007年
- [目的]研究低分子量肝素对骨肉瘤细胞增殖和survivin表达的影响。[方法]体外培养骨肉瘤细胞系MG-63,应用MTT法检测不同浓度低分子量肝素不同时间段对骨肉瘤细胞系MG-63生长的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,免疫组化和RT-PCR法分析低分子量肝素对骨肉瘤细胞survivin基因表达的影响。[结果]低分子量肝素可抑制骨肉瘤细胞系MG-63生长,且随着低分子量肝素剂量的增加,MG-63细胞凋亡率明显增加。免疫组化和RT-PCR显示,骨肉瘤细胞系MG-63中survivin的表达较用药前明显下降。[结论]低分子量肝素对骨肉瘤细胞系MG-63有明显的抑制作用,其作用可能通过抑制抗凋亡基因survivin的表达,促进肿瘤细胞的凋亡而实现。
- 易磊郭风劲陈安民祝文涛宋登新张树威胡伟华李明辉
- 关键词：低分子量肝素骨肉瘤SURVIVIN细胞凋亡
- 骨骺生长板PTHrp-Ihh信号轴及相关因子调节机制研究进展被引量：8
- 2007年
- 甲状旁腺素相关肽(PTHrp)-印第安刺猬蛋白(Ihh)信号轴是骨骺生长板中调节软骨和成骨细胞增殖、分化、肥大和矿化的重要负反馈轴。围绕该信号轴有多种生长因子如Sox9、BMP、TGF-β等,参与调控软骨及成骨细胞生长。新近研究表明,PTHrp通过Sox9阻止软骨前体细胞向肥大软骨细胞转化,通过抑制BMP-6阻止软骨细胞成熟,通过抑制BMP-4阻止软骨细胞凋亡;通过下调Ihh、BMP-6表达,TGF-β抑制软骨细胞分化;通过激活FGFR-3,可下调PTHrp、Ihh表达,抑制软骨细胞增殖;Ihh除具有促进软骨细胞增殖的作用外,还促进软骨膜上成骨细胞的分化,从而加速成骨。彻底弄清骨骺生长板中PTHrp-Ihh信号轴及相关因子的调节机制,对于治疗一些遗传性疾病、修复软骨及骨缺损有着重要的临床意义。该文围绕PTHrp-Ihh信号轴及相关因子对软骨细胞调控机制研究进展作一综述。
- 李明辉郭风劲
- 关键词：甲状旁腺素相关蛋白软骨内成骨
- pTet-on骨骺干细胞株的建立和pTRE-甲状旁腺相关蛋白（1—36）反应质粒的构建被引量：1
- 2008年
- 目的建立pTet—on骨骺干细胞株，克隆甲状旁腺相关蛋白[PTHrP（1—36）]基因并构建反应质粒pTRE—PTHrP（1—36）。方法用脂质体介导的基因转染技术将pTet—on质粒转染于永生化骨骺干细胞，G418筛选得到稳定克隆，再瞬时转染pTRE-2Hyg—Luc质粒并筛选出高水平诱导、低背景表达的永生化骨骺干细胞系。以RT—PCR方法获得带有酶切位点PTHrP（1—36）基因片段，与载体pTRE-2Hyg均双酶切后连接，转化扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定。结果筛选到1株诱导后荧光素酶的表达活性增加50倍的骨骺干细胞系；经酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已经插入重组质粒。结论筛选得到的永生化骨骺干细胞株受强力霉素诱导后能够低背景、高水平表达；成功克隆PTHrP（1—36）基因并构建了反应质粒pTRE—PTHrP（1—36），为进一步精确调控PTHrP（1—36）基因的表达奠定了基础。
- 张树威陈安民李明辉祁军宋登新祝文涛廖晖郭风劲
- 关键词：骨骺强力霉素基因表达调控甲状旁腺相关蛋白
- 大鼠骨骺干细胞的分离鉴定及其永生化细胞株的构建被引量：5
- 2007年
- [目的]分离、鉴定大鼠骨骺干细胞并建立永生化的大鼠骨骺干细胞株,为细胞移植和转基因治疗提供稳定的细胞来源。[方法]采用Percoll不连续密度梯度离心法分离骨骺干细胞,利用电穿孔转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)的质粒pCMVSV40T/PUR转染骨骺干细胞,经嘌呤霉素筛选,抗性克隆扩大培养。应用FGFR-3抗体和PCNA抗体进行免疫细胞化学染色,观察细胞的形态及其生长状况并绘制细胞生长曲线。用免疫细胞化学法和RT-PCR检测SV40Tag在转染细胞中的表达。[结果]转染后获得一个阳性细胞克隆,免疫细胞化学结果显示FGFR-3抗体染色阳性。SV40Tag抗体染色和RT-PCR结果显示SV40Tag已稳定转染入骨骺干细胞。转染细胞经扩大培养,命名为永生化骨骺干细胞。[结论]成功纯化大鼠骨骺干细胞并构建了SV40Tag永生化的骨骺干细胞株。
- 张树威陈安民郭风劲胡伟华李明辉廖晖祝文涛宋登新
- 关键词：骨骺干细胞永生化
- 受强力霉素调控的永生化骨骺干细胞株的建立被引量：3
- 2007年
- 目的:建立受强力霉素调控高表达外源基因的真核表达体系-永生化骨骺干细胞株,为调控甲状旁腺相关肽的不同片断在骨骺干细胞中的表达打下基础。方法:实验于2006-09/2007-03在同济医学院矫形外科实验室完成。①实验材料:SD大鼠的乳鼠由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供,雄鼠4只,雌鼠6只。②实验方法:取SD大鼠的乳鼠10只,显微镜下选取LaCroix环处的软骨及软骨前体细胞(骨骺干细胞),采用磁性细胞分选的方法,分离出原代骨骺干细胞,并用PCMVSV40质粒将其永生化。用脂质体介导法将pTet-on质粒转染已永生化的骨骺干细胞,通过G418筛选并经有限稀释法进行单克隆化,得到稳定转染的抗性克隆并将其分别扩增培养。将pTRE2hyg-luc质粒瞬时转染扩增后的单克隆细胞,加入终浓度为1mg/L的强力霉素诱导剂培养,48h后逐一检测每个细胞株的荧光素酶表达活性,逐一筛选强力霉素调控高表达外源基因的永生化骨骺干细胞株。③实验评估:将挑选出的第23号克隆扩增培养,加入0.01,0.1,0.5,1,5mg/L强力霉素进行诱导培养,并设置3组对照,一组为空白对照(蒸馏水),一组为未转染Tet-on系统的骨骺干细胞(均加入1mg/L0.1mg/强力霉素诱导),另一组为转染后的骨骺干细胞不加入强力霉素诱导。观察强力霉素对骨骺干细胞的最优诱导质量浓度。结果:第23号克隆的细胞经诱导后荧光素酶的表达活性为85790,而非诱导状态下该细胞株的活性为437,诱导后的活性增加196.3倍。强力霉素质量浓度梯度实验提示,强力霉素的最优诱导质量浓度是1mg/L左右,质量浓度过高可导致细胞死亡,过低时诱导效率降低。结论:永生化骨骺干细胞株可用于真核调控高表达,为研究甲状旁腺相关肽的不同功能片断与骨骺干细胞的分化机制的关系打下了基础。
- 李明辉郭风劲张树威宋登新王江易磊
- 关键词：基因表达调控干细胞强力霉素
