徐正刚
- 作品数：12 被引量：25H指数：3
- 供职机构：山东农业大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：山东省农业良种工程项目国家高技术研究发展计划国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 睾丸注射法制备携带猪PID1基因的转基因兔被引量：2
- 2014年
- 目的研究磷酸酪氨酸互作结构域1(PID1)基因与肌内脂肪含量的关系,探究睾丸注射法在转基因动物制备中的可行性。方法将携带猪PID1基因的重组质粒pIRES2-acGFP-PID1与转染试剂共孵育后,对新西兰兔进行了睾丸打点注射试验。对繁殖的F1代个体进行了活体荧光检测、PCR和western blotting检测,以及抽样屠宰进行肌内脂肪含量等检测;将F1代阳性个体互交,繁殖了F2代兔,对其进行了阳性率检测以及肌内脂肪含量检测。结果外源PID1基因和荧光蛋白基因在后代中均成功表达,其中,F1代阳性率为35.88%,F2代阳性率为34.33%;转基因阳性兔与阴性和空白对照兔相比,PID1蛋白表达水平有所增加,肌内脂肪含量有显著提高(P<0.05)。结论 PID1基因与肌内脂肪沉积密切相关,同时,进一步证明了睾丸注射法可以用于制备转基因动物,且外源基因可以稳定遗传。
- 祝洪磊石元曾勇庆陈伟徐正刚张哲杨云张天阳
- 关键词：转基因兔肌内脂肪
- RNA干扰沉默PID1基因在C2C12细胞中表达的研究被引量：3
- 2013年
- 构建和筛选对PID1(phosphotyrosine interaction domain containing 1,PID1)基因有RNA干扰作用的PID1-shRNA表达载体。据小鼠PID1 cDNA序列,优化设计了4条shRNA及1条阴性干扰序列,插入pGPU6/GFP/Neo载体中,得到pGPU6/GFP/Neo-PID1-1、pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3、pGPU6/GFP/Neo-PID1-4和pGPU6/GFP/Neo-PID1-NC。干扰载体转染C2C12细胞,以RT-PCR和Western blot技术检测shRNA对C2C12细胞中PID1 mRNA和蛋白表达的下调作用。结果表明:靶向PID1基因的4个shRNA重组质粒载体经测序分析,其shRNA编码序列与预期设计的完全一致,经酶切鉴定和测序分析证实,靶向PID1基因的shRNA重组质粒载体构建成功。进一步将构建的4个表达载体分别转染C2C12细胞,24 h后细胞中PID1基因mRNA表达水平依次下调(23.58±1.87)%、(75.44±0.77)%、(70.52±0.41)%和(56.60±3.13)%。48 h后细胞中PID1蛋白表达水平依次降低(30.15±5.05)%、(71.86±4.85)%、(67.93±2.28)%和(56.81±2.01)%。所筛选出的pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3和pGPU6/GFP/Neo-PID1-4三个表达载体均能高效地抑制转染细胞PID1 mRNA和蛋白的表达,为进一步研究PID1基因的功能奠定了基础。
- 杨伦徐正刚王慧陈其美陈伟胡艳霞石元祝洪磊曾勇庆
- 关键词：小鼠RNA干扰
- RNA干扰沉默PID1基因肉兔模型的构建被引量：4
- 2014年
- 为进一步研究PID1基因的功能,本试验在前期构建并筛选得到的高效PID1RNA干扰表达载体pGPU6/GFP/Neo-PID1-2的基础上,利用精子介导法制备RNA干扰PID1转基因肉兔模型。对繁殖的F1代肉兔个体进行活体荧光检测、PCR、RT-PCR和Western blot检测,并对不同组别(阳性组、阴性组和空白对照组)体重达3.0kg左右的F1代肉兔抽样屠宰进行肌内脂肪的测定。研究结果表明:外源基因和绿色荧光蛋白基因(GFP)在转基因兔后代中可成功表达,试验组得到F1代个体106只,其中阳性兔7只,转基因阳性率为6.60%。PID1基因RNAi阳性兔与阴性兔、空白对照兔相比,RT-PCR检测PID1基因mRNA表达量显著降低(P<0.05),Western blot测得PID1蛋白表达水平呈下降趋势,肌内脂肪的含量显著降低(P<0.05);综上表明,PID1基因与肌内脂肪沉积密切相关。本研究从RNAi肉兔模型构建的角度进一步验证了PID1基因对肌内脂肪沉积影响的功能,也为下一步研究制备高肌内脂肪优质PID1转基因猪奠定了基础。
- 徐正刚杨伦曾勇庆张哲陈伟杨云房国锋王守栋
- 关键词：新西兰肉兔RNA干扰肌内脂肪
- RNA干扰沉默PID1转基因肉兔模型的构建
- 徐正刚杨伦曾勇庆陈伟张哲杨云王守栋房国锋楚青惠
- 关键词：新西兰肉兔RNA干扰肌内脂肪
- 睾丸注射法制备携带猪PID1基因的转基因兔
- 祝洪磊石元曾勇庆陈伟徐正刚张哲杨云张天阳
- 关键词：转基因兔肌内脂肪
- RNA干扰沉默PID1基因肉兔模型的构建及猪PID1基因多态性与肌内脂肪含量关联分析
- 随着人们生活水平的不断提高，猪肉的品质也随之受到人们越来越多的关注。众多肉品质性状之中，肌内脂肪(IMF)是衡量猪肉品质的一个非常重要的指标，其含量与猪肉的多汁性、嫩度以及风味密切相关。有研究发现，肥胖人群脂肪细胞的增殖...
- 徐正刚
- 关键词：新西兰肉兔RNA干扰肌内脂肪肉质性状
- 文献传递
- 猪P311基因内含子1多态性检测及其与肌内脂肪含量的关联分析
- 杨云陈伟曾勇庆张哲徐正刚魏述东徐云华孙延晓
- 关键词：SNP肌内脂肪
- 2A肽介导猪PID1与CuZnSOD双基因真核共表达载体的构建与细胞表达
- 2014年
- 构建PID1基因与CuZnSOD基因的真核共表达载体,在PK15细胞中鉴定基因的表达。PCR扩增的PID1与CuZnSOD两基因分别经双酶切后定向插入pIRES2-AcGFP1空载体,构建pIRES2-CuZnSOD-PID1真核双表达载体并进行测序与酶切鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒转染至PK15细胞,细胞内荧光显微镜下观察其荧光的表达,RT-PCR、Westernblot技术分别检测PID1基因与CuZnSOD基因mRNA和蛋白表达情况。重组克隆载体插入目的片段序列与PID1基因与CuZnSOD基因序列完全一致。PIRES2-CuZnSOD-PID1真核双表达载体测序、酶切鉴定结果与预期结果一致。荧光显微镜下观察转染后的PK15细胞出现绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,转染细胞中PID1基因与CuZnSOD基因表达量明显高于对照组(P<0.05)。Westernblot检测结果表明pIRES2-CuZnSODPID1真核双表达载体稳定有效表达。成功构建pIRES2-CuZnSOD-PID1真核共表达载体,且双基因在真核细胞独立稳定表达,为转基因猪等育种新材料的制备奠定基础。
- 张哲李同明曾勇庆陈伟徐正刚杨云房国锋王守栋楚青惠
- 关键词：CUZNSODPK15细胞
- 饲喂不同剂量乳酸菌液对肥育猪肉质特性及抗氧化性的影响被引量：13
- 2014年
- 为研究饲喂不同剂量乳酸菌液对肥育猪肉质特性及抗氧化性的影响，选择80日龄、体重约30 kg的杜长大三元杂种猪216头，随机分成4组，每组54头（3个重复，每个重复18头）；3个试验组乳酸菌液每天每头饲喂量分别为50、100、150 mL （乳酸菌菌落数分别为0.5＆#215;1011、1＆#215;1011、1.5＆#215;1011个），对照组不饲喂乳酸菌液。试验猪饲喂至平均约100 kg体重，每组随机抽样屠宰5头，取背最长肌进行肉质及抗氧化性测定。结果表明，各组试验猪的肌肉失水率、滴水损失、烹饪损失差异显著（P＆lt;0.05），并且3个性状具有相同的变化趋势，表现为150 mL组＜100 mL组＜50 mL组＜对照组，150 mL组的失水率、滴水损失和烹饪损失分别比对照组降低7.07%、9.28%和4.41%（P＆lt;0.05）。各组试验猪的肌肉剪切力差异显著（P＆lt;0.05），3个试验组均低于对照组，其中100 mL组比对照组降低11.16%（P＆lt;0.05）。饲喂乳酸菌液对肉色、大理石纹、拿破率和常规化学成分无显著影响（P＆gt;0.05），但对肌肉SOD（超氧化物歧化酶）活性影响显著，50 mL组、100 mL组和150 mL组的SOD活性分别比对照组提高12.19%、39.05%和34.81%（P＆lt;0.05），而肌肉MDA（丙二醛）含量则有下降的变化趋势。研究证明，饲喂乳酸菌液（每天每头100～150 mL）能够明显提高猪肉的系水力、嫩度和抗氧化性能。结果提示，乳酸菌液作为商品肉猪肉质改良的饲料添加剂具有独特的开发利用价值。
- 张天阳徐海鹏曾勇庆汪官保徐正刚袁广振张建梅赵勇谢伟仕
- 关键词：肉质特性抗氧化性
- 猪CuZnSOD基因启动子的克隆鉴定及分析被引量：3
- 2014年
- 猪铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)是一种重要的抗氧化酶,其功能已被广泛研究,但CuZnSOD基因的转录调控尚不明确。为了研究猪CuZnSOD基因的核心启动子区域,并对其转录调控机制进行探讨,运用PCR方法从猪基因组克隆CuZnSOD基因5′上游调控区853 bp的片段,然后通过巢式PCR方法获得5′末端逐渐缺失的启动子系列片段,并将这些片段定向插入到荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中。瞬时转染小鼠胚胎细胞(NIH/3T3),利用双荧光素酶报告基因检测不同长度启动子活性。检测结果显示,在CuZnSOD基因5′上游调控区-87 bp和-266 bp处分别存在2个潜在转录起始位点,-383 bp^+67 bp启动区活性最强,进一步缺失分析发现-75 bp^-32 bp区域内含有猪CuZnSOD基因转录所必需的基础启动子序列,其中存在多个潜在的转录因子结合位点,研究结果提示这些转录因子结合位点可能是参与CuZnSOD基因转录的重要调控序列。
- 石元陈伟曾勇庆祝洪磊徐正刚张哲杨云张天阳
- 关键词：启动子
