周前进
- 作品数：71 被引量：112H指数：7
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- 相关领域：农业科学生物学医药卫生环境科学与工程更多>>
- 用于创伤弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列
- 本发明公开了用于创伤弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列，特点是包括三对LAMP的引物TolC-F3、TolC-B3、TolC-FIP、TolC-BIP、TolC-LF、TolC-LB和一条探针TolC--HP步骤...
- 陈炯周前进
- 文献传递
- 捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的原核表达及重组蛋白酶活性测定被引量：2
- 2017年
- 【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一,该病在中国呈全国性流行。为研究捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性,对其基因进行了克隆、原核表达,并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸β氧化中的作用。【方法】根据NCBI公布的H.contortus ZJ株daf-22 cDNA序列(Gen Bank:HQ738470.1)设计特异性引物,克隆Hc-daf-22基因并构建重组质粒pET-22b-Hc-daf-22,经测序鉴定正确后将其转化E.coli BL21,经终浓度为0.1 m mol·L^(-1) IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达4h,离心菌液,50 mmol·L^(-1)浓度的PBS溶液重悬菌体溶液,冰浴超声破碎后上清沉淀分别进行SDS-PAGE分析。超声破碎后产物以镍柱亲和色谱法分离纯化重组蛋白Hc-DAF-22,并用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况及以抗His血清作为一抗Western Blot鉴定。纯化后蛋白用超滤管浓缩除去盐分,并按照蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。利用天然状态下的乙酰乙酰CoA(AcAc-CoA)分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物特性,酶活试验以乙酰乙酰辅酶a为底物建立标准曲线。硫解酶体外测活体系为(50 mmol·L^(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L^(-1) MgCl_2,60μmol·L^(-1)CoA,10μmol·L^(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白),通过记录反应过程中由于底物(AcAc-CoA)的减少而引起303 nm波长下的吸收值的变化,从而计算出硫解反应的初始反应速率,最终确定复性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性。在相同条件下,取AcAc-CoA底物浓度为10μmol·L^(-1)的反应体系(50 mmol·L^(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L^(-1)MgCl_2,60μmol·L^(-1) CoA,10μmol·L^(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白于室温起始反应),分别调节反应体系的温度及pH梯度,确定Hc-DAF-22最佳酶活反应温度及pH条件。【结果】成功克隆Hc-daf-22基因,测序结果与NCBI已公布的H.
- 郑秀平丁豪杰郭筱璐杨怡黄艳陈学秋周前进杜爱芳
- 关键词：捻转血矛线虫原核表达酶活测定
- 副溶血弧菌特异性卵黄抗体(AHPND-VpIgY)对凡纳滨对虾幼体被动免疫和育苗成活率的影响被引量：9
- 2019年
- 将抗高致病性副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)特异性卵黄抗体(AHPND-VpIgY)应用于育苗生产,通过测定氨氮、亚硝酸盐、细菌总数、弧菌总数、相对保护率和育苗成活率,评价了AHPND-VpIgY在育苗期对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)幼体的保护效果。结果表明,0.1g/m3和0.2g/m3AHPND-VpIgY组的相对保护率为35.7%和57.2%,两者均显著高于非特异性卵黄抗体组(P<0.05);两组的育苗成活率为50.8%和57.2%,比对照组分别提高19.1%和25.6%。各实验组氨氮、亚硝酸盐、细菌总数及弧菌总数与对照组无显著差异,对水质无影响。综上,特异性的AHPND-VpIgY能在不改变水质的前提下,有效提高凡纳滨对虾幼体的存活率、相对保护率和育苗成活率,从而提高凡纳滨对虾苗种产量和质量。
- 闫茂仓王瑶华王瑶华胡利华张炯明唐明唐明黄贤克黄贤克周前进
- 关键词：凡纳滨对虾副溶血弧菌卵黄抗体育苗期
- 秀丽隐杆线虫全身性与组织特异性表达重组载体的构建
- 2009年
- 利用PCR技术从秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)基因组DNA中扩增获得Act-1基因的核心启动子序列、T07F10基因的核心启动子序列与3UTR的Poly(A)信号序列以及从表达载体pEGFP-N1上扩增获得SV40早期mRNA的Poly(A)信号序列与EGFP基因.以克隆载体pBluescript SK+为基本骨架,分别构建由Act-1基因的核心启动子序列、T07F10基因的核心启动子序列调控的、EGFP作为报告基因的秀丽隐杆线虫全身性表达重组载体和组织特异性表达重组载体,为研究不同类型载体在秀丽隐杆线虫体内的表达模式提供基础.
- 周前进姜小磊张红丽杜爱芳
- 关键词：秀丽隐杆线虫核心启动子EGFP基因组织特异性表达
- 用于孔石莼LAMP-LFD检测的引物和探针序列
- 本发明公开了用于孔石莼LAMP-LFD检测的引物和探针序列，特点是根据基因库登录号为HQ902008的孔石莼内转录间隔区序列的编码序列设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列，引物的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1-6...
- 陈炯周前进
- 文献传递
- 东海温州水域4类常见耐药基因的流行情况研究被引量：2
- 2021年
- 磺胺类、四环素、喹诺酮类和多粘菌素抗生素是医学与养殖业中的常用抗生素,其中多粘菌素在畜牧养殖业中常作为促长剂添加。调查分析了这4类抗生素的常见耐药基因在东海温州近海水域的分布情况。利用抗性平板筛选温州近海水域对磺胺类、四环素类及喹诺酮类抗生素耐药的可培养细菌分离株,对耐药分离株通过PCR方法进行目标耐药基因检测;对目标耐药基因阳性的耐药分离株进行多粘菌素耐药基因MCR检测以及采用微量二倍稀释法测定对上述4类抗生素的耐药性。结果表明,利用抗性平板筛选获得可培养耐药分离株1 605株,从中筛选到目标耐药基因阳性的51株,检出率为3.18%,包括含磺胺类耐药基因35株、含四环素耐药基因36株、含喹诺酮耐药基因17株、含多粘菌素耐药基因2株;51株耐药菌归于7个菌属,其中气单胞菌属(Aeromonas sp.) 43株,占比84.31%,枸橼酸杆菌属(Citrobacter sp.)和希瓦氏菌属(Shewanella sp.)各2株,埃希氏菌属(Escherichia sp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)、Thalassobius sp.及Amphritea sp.各1株;上述2株非常见分离株不统计在内,常见的49株均对四环素耐药, 41株对多粘菌素耐药,对磺胺类和喹诺酮类耐药的分离株均为34株;同时,发现23株对4类抗生素均产生耐药, 16株对多达3种抗生素耐药,多重耐药现象普遍存在。同时,鉴定出MCR-3阳性的条件致病菌维氏气单胞菌和豚鼠气单胞菌各1株。综上,温州市近海水域中含有常见耐药基因的耐药分离株检出率较低,但同一耐药基因的细菌分布多样,对磺胺类、四环素类、喹诺酮类及多粘菌素类等4类抗生素表现出较强的耐药性,多重耐药现象明显。研究结果将为评估温州近海水域的细菌耐药性风险,规范抗生素的使用提供科学依据。
- 金晶磊周前进邵鑫斌王瑶华陈炯闫茂仓苗亮唐标张严峻
- 关键词：耐药基因多重耐药
- 抗弓形虫MIC3单抗的制备及其在速殖子免疫荧光观察中的应用被引量：4
- 2011年
- 为开展弓形虫速殖子阶段蛋白表达和定位的相关研究,利用弓形虫重组微线体蛋白3(MIC3)抗原研制单克隆抗体,筛选出适合在虫体内用免疫荧光观察该蛋白的单抗分泌株,建立了弓形虫间接免疫荧光观察方法。结果显示,经4轮亚克隆后得到3株稳定分泌抗MIC3单抗的分泌株:4G1、1G12和5D7;经测定,3株MIC3单抗4G1、1G12和5D7的亚型分别为IgG1、IgG2b、IgG2b,效价分别为1∶3 200、1∶12 800、1∶1 600。筛选得到的2株MIC3单抗(4G1和1G12)可用于间接免疫荧光检测MIC3蛋白在虫体中的分布。通过弓形虫阳性感染猪血液样品推片的免疫荧光试验,验证了这3株单抗具有特异性。结果表明,研制的MIC3单抗和虫体荧光观察体系可用于速殖子MIC3蛋白在虫体表达定位和其他研究,也可作为其他速殖子抗原荧光观察的比较对象。
- 刘钊禹海杰卓洵辉周前进杜爱芳
- 关键词：弓形虫单克隆抗体
- 环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测迟缓爱德华菌被引量：8
- 2017年
- 将环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术与横向流动试纸条(latera flowdipstick,LFD)联合应用,建立LAMP-LFD方法,用于迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)的快速检测。根据E.tarda外膜蛋白A(outer membrane protein A,ompA)基因的保守区设计了6套LAMP引物,并筛得1套最适引物用于后续LAMP反应。将该套引物的上游内引物5′端用生物素标记,同时在有效扩增区段内设计1条探针ompAHP,使用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记,用于试纸条显色。结果表明,优化后的LAMP反应条件为63℃ 25min,LAMP-LFD对嗜水气单胞菌等致病菌检测结果均呈阴性,对病原菌纯培养物的检测灵敏度为1.0×10~2 CFU/mL,是常规PCR检测灵敏度的100倍。对E.tarda人工污染组织样品的灵敏度为5×10~2 CFU/mL或1.0×10~4 CFU/g。因此,LAMP-LFD可特异地检出E.tarda,且灵敏度高、操作简便、时间短、有潜力成为检测E.tarda的常规方法。
- 柴方超周前进陈炯
- 关键词：迟缓爱德华菌环介导等温扩增特异性灵敏度
- 孔石莼(Ulva pertusa)LAMP-LFD快速检测方法的建立被引量：1
- 2016年
- 采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)进行核酸扩增,凭借横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)完成扩增产物检测,建立了可快速检测孔石莼(Ulva pertusa)的LAMP-LFD方法。该方法首先在孔石莼的内转录间隔区序列(internal transcribed spacer,ITS)的8个种内保守区域设计6条特异性引物(上游内引物由生物素标记),进行由生物素标记的LAMP反应;同时,在两条外引物的有效扩增区段内设计1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针,生物素标记的LAMP产物与FITC标记的探针特异性杂交后,在LFD上完成结果显示。优化后LAMP的反应条件为63°C反应50min,加上探针杂交与LFD检测共需60min。结果表明,利用该LAMP-LFD方法可特异性地检出孔石莼,对浒苔(Ulva prolifera)等9种常见藻类的检测均呈阴性。利用该方法最低可检测到3.04×10^(–2) pg/μL的孔石莼基因组DNA,是以LAMP外引物进行的常规PCR方法的1000倍。针对一定数量的实际样本的检测结果表明,LAMP-LFD方法与传统的形态学观察的结果一致。因此,本研究建立的孔石莼LAMP-LFD快速检测方法,具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,有望成为我国东部沿海孔石莼快速检测和定期监测的有效技术手段。
- 周前进陈先锋蔡怡段丽君段维军苗亮陈炯
- 关键词：孔石莼内转录间隔区环介导等温扩增技术
- 利用秀丽隐杆线虫表达捻转血矛线虫H11蛋白的转基因研究
- 捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是牛、羊等反刍动物的主要寄生性线虫,寄生于动物皱胃粘膜的表面,引起捻转血矛线虫病,导致动物出现贫血、消瘦,甚至引起死亡。使用抗蠕虫药物是目前防治该病的主要措施,但线...
- 周前进
- 关键词：捻转血矛线虫基因组结构秀丽隐杆线虫核心启动子疫苗候选抗原
- 文献传递
