袁作为
- 作品数：8 被引量：12H指数：2
- 供职机构：重庆医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体的快速鉴别诊断试剂盒研制
- 目前所有候选的人类免疫缺陷病毒(HIV)疫苗均含有多种HIV病毒基因或基因产物并刺激机体产生相应抗体,这些抗体与HIV自然感染产生的抗体几乎没有差异,用目前HIV血清诊断试剂盒诊断为阳性,导致误诊。疫苗所致的假阳性结果不...
- 袁作为
- 关键词：自然感染疫苗抗体阳性血清抗原肽
- 荧光定量分型PCR、多重PCR和测序检测HBV基因型的方法学比较被引量：3
- 2010年
- 目的 比较荧光定量分型PCR、直接测序和多重PCR三种HBV基因分型法,对本实验室建立的荧光定量分型PCR方法进行评价.方法 用多重PCR、直接测序和荧光定量分型PCR法检测113份HBV DNA阳性的临床样本.结果 荧光定量分型PCR和直接测序法检出率100%,多重PCR法检出率94.69%,6份样本未能分型.荧光定量分型PCR和多重PCR的Kappa系数0.915,荧光定量分型PCR和直接测序法的Kappa系数0.742,一致性均较好.对B/C基因型混合感染样本,荧光定量分型PCR法检出28例（24.78%）,多重PCR法检出19例（16.81%）,直接测序法检出13例（11.50%）.结论 荧光定量分型PCR分型结果准确可靠,对基因型混合感染样本的检出率明显高于多重PCR及直接测序法,是一种高效、简便、快速、准确的HBV基因分型法,适用于大规模流行病学调查.
- 张秀瑜赵耀张文露胡源袁作为黄爱龙
- 关键词：乙型肝炎病毒基因型实时荧光定量PCR测序多重PCR
- 艰难梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶的原核表达、纯化及其酶活性被引量：1
- 2013年
- 目的原核表达艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile,CD)谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GDH),纯化重组蛋白,并检测其酶活性。方法采用PCR法从标准株ATCC BAA-1805中扩增GDH基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28-GDH,转化感受态大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,并通过Ni-NAT层析柱分离纯化后,根据脱氢酶酶活测定方法,测定纯化蛋白的酶活性。结果重组表达质粒pET-28-GDH经双酶切及测序,证实构建正确,重组蛋白的相对分子质量约46 000,可与抗His单抗特异性结合,主要以可溶性形式表达。纯化的目的蛋白纯度可达90%,浓度为1.7 mg/ml。纯化蛋白GDH以NADPH和NADP为辅酶,酶活性分别为42.6和63.3 U/L。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CD GDH,纯化的目的蛋白纯度高,具有GDH酶活性,为制备GDH单克隆抗体奠定了基础。
- 杜茜吴志鹃蔡雪飞袁作为张君郑建
- 关键词：谷氨酸脱氢酶基因表达纯化酶活性
- HIV疫苗研究进展被引量：1
- 2010年
- 自上世纪80年代发现第一例艾滋病人以来，艾滋病发病率急剧上升，为了控制急剧上升的流行趋势，在20多年间，研究者们研发了数百种艾滋病疫苗，但疫苗临床试验几乎都以失败告终。直到2009年底，由赛诺菲-巴斯德公司（Sanofi—Pasteur）和瓦克斯根（VaxGen）公司合作的联合疫苗Ⅲ期临床试验才初见成效，这给艾滋病疫苗研究带来了希望。本文就较有潜力的艾滋病疫苗作用机制、研究策略以及临床试验进行综述，展望未来艾滋疫苗的研究方向。
- 袁作为郑建
- 关键词：HIV艾滋病疫苗
- HIV跨膜蛋白gp41和gp36原核表达及抗原性研究被引量：2
- 2010年
- 目的构建HIV跨膜蛋白gp41和gp36原核表达载体,诱导表达HIV抗原,为HIV快速诊断和蛋白疫苗研究提供材料基础。方法用PCR方法对HIV-1包膜蛋白gp41和HIV-2包膜蛋白gp36基因序列进行全长、截短扩增,分别或以融合表达方式克隆入原核表达载体pQE30、pET32a（＋）及pGST-MOLUC,重组质粒经异丙基硫代半乳糖苷（isopro-pyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达,并经Ni-NAT或谷胱甘肽-Sepharose-4B层析柱亲和纯化HIV跨膜糖蛋白抗原,对获得的纯化抗原进行Western blot检测,利用HIV抗原制备ELISA检测试剂盒,并分析HIV临床样本。结果成功构建了HIV包膜蛋白的原核表达载体,利用亲和层析纯化得到了纯度较高的HIV包膜蛋白;Western blot分析结果证实表达纯化的HIV跨膜蛋白gp41（aa.538~718）、gp36（aa.533~764）以及gp41-gp36均能和HIV阳性血清反应;ELISA试剂盒检测临床样本显示,特异性达95%以上,灵敏度达100%。结论获得了有生物学活性的HIV截短包膜蛋白,并可用于HIV快速检测试剂盒的研发。
- 袁作为帅光泽张君胡接力郑建
- 关键词：抗原性
- HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别肽的原核表达及纯化被引量：1
- 2011年
- 目的原核表达并纯化HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别肽sk1、sk2、sk3及3条肽段串联序列。方法用普通PCR及重叠延伸PCR法从HIV-1 B亚型质粒扩增得到sk1、sk2、sk3基因序列及3条肽段基因片段的6种连接序列,并分别克隆入原核表达载体pET-32a(+)及pGEX4T-2中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Ni-NAT或谷胱甘肽-Sepharose-4B层析柱亲和层析纯化。SDS-PAGE分析融合肽的表达,Western blot分析融合肽的抗原性。结果分别以pET-32a(+)和pGEX4T-2为载体,共构建了18个重组表达质粒;his-sk1、his-sk123、his-sk213、his-sk231及GST-sk3、GST-sk123、GST-sk213分别在pET-32a(+)及pGEX4T-2表达载体中以可溶形式表达,且均能与HIV-1阳性血清反应,而不能与HIV DNA-天坛疫苗免疫血清反应;经大量诱导表达纯化后,GST-sk3表达量最高,可达40 mg/L,纯度超过90%。结论已成功表达并纯化了具有生物学活性的HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别肽,为研制HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别诊断试剂盒奠定了基础。
- 袁作为张君胡接力张秀瑜黄爱龙郑建
- 关键词：HIV自然感染疫苗抗体抗原肽
- RtS246T变异对HBV恩替卡韦敏感性的影响--一种新的HBV体外表型分析策略
- 胡接力黄爱龙崔静郭进军张文露袁作为李青岭邓小燕曾爱中唐霓
- 1.1倍全长HBV基因组克隆转染细胞系的建立被引量：5
- 2011年
- 目的构建pneo-CH9/3091真核表达质粒,并建立其稳定表达的HepG2细胞系。方法质粒pCH9/3091包含HBV1.1倍体和CMV启动子,将PCR扩增出的带有新霉素(neo)抗性的基因片段插入pCH9/3091构建成重组质粒pneo-CH9/3091。重组质粒经酶切,测序验证正确后,通过脂质体介导转入人肝癌细胞HepG2。G418筛选后,利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测所得单克隆细胞培养上清液的HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg),PCR检测细胞上清液的病毒颗粒,Western blot检测细胞内HBV核心蛋白(HBcAg)的表达,以及Southern blot检测细胞内核心颗粒HBV DNA的复制情况。结果有3株细胞系培养上清HBsAg和HBeAg检测呈现阳性,且HBV C区片段可通过PCR扩增出来,West-ern bot结果提示只有细胞株HepG2-H7可以表达HBV核心蛋白。Southern blot结果说明此细胞株基因组中有HBV基因组的稳定整合,并且能在细胞内检测出HBV DNA复制中间体。结论成功构建1株HBV稳定整合细胞株HepG2-H7,能持续产生HBV病毒颗粒。
- 罗强苏怀彬梁盼盼袁作为张文露黄爱龙胡接力
- 关键词：乙肝病毒HEPG2细胞
