李丰耀
- 作品数：10 被引量：7H指数：2
- 供职机构：暨南大学生命科学技术学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- HLA-A^＊2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定被引量：2
- 2007年
- HLA-A*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒(HCMV)特异性细胞毒T细胞(CTL)免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白(HLA-A*2402-BSP)的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E.coli)中有效表达HLA-A*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端(N端)区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E.coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A*2402限制性HCMVpp65341-349抗原肽(QYDPVAALF,QYD)的可溶性HLA-A*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24+供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8+T细胞的0·09%～0·37%。这些结果为进一步研究HLA-A*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。
- 贾仟涛徐丽慧李丰耀查庆兵何贤辉
- 关键词：四聚体巨细胞病毒密码子优化原核表达包涵体
- 负载HCMV pp65抗原肽的HLA-A*1101-GPI四聚体的制备和鉴定
- 目的：构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体，在大肠杆菌中表达该融合蛋白，并进一步制备负载人巨细胞病毒(HCMV)pp65抗原肽的H...
- 李丰耀
- 关键词：四聚体
- 文献传递
- 茂名大雾岭中次生林植被蚯蚓多样性的空间特征
- 2003年
- 在样方调查的基础上,研究大雾岭天然次生林中大田顶、茄顶两座山东、南、西、北四个坡向植物多样性、蚯蚓多样性和土壤有机质含量。结果表明:大雾岭天然次生林 1)乔木总数以南坡偏低,在大田顶、茄顶南坡分别0Ind·m^(-2)和0.06 Ind·m^(-2);各坡向乔木Shannon-Weaver指数在0～2.24之间,Margalef指数在0～3.15之间,乔木多样性指数没有坡向差异;2) 灌木总数没有坡向差异,灌木多样性指数南坡最低,Shannon-Weaver指数与Margalef指数在大田顶南坡分别为1.52和1.70,在茄顶南坡则分别为2.05和2.33;3) 草本植物总数以南坡最高,在大田顶、茄顶南坡分别有87Ind·m^(-2)与244 Ind·m^(-2);草本植物多样性指数以南坡较高,其中Shannon-Weaver指数与Margalef指数在大田顶南坡分别为2.46与3.36;4) 蚯蚓总数以南坡偏低,在大田顶与茄顶分别为7 Ind·m^(-2)和0 Ind·m^(-2);各坡向蚯蚓Shannon-Weaver指数在0～1.63之间,Margalef指数在0～2.20之间,蚯蚓多样性指数没有坡向差异:5)土壤有机质无坡向差异,各坡向离地面50cm以内的土壤有机质含量在11.2～40.6％,离地面0.5～1 m的有机质含量在5.6～17.5％。由于生物资源分布有坡向差异,因此在天然次生林管理时可根据不同的坡向选择相应的开发或保护模式。
- 范明铭许忠能丘明霞黎婉华马霭能黄泽棋黄滔李丰耀李丰耀
- 关键词：次生林坡向生物多样性植被蚯蚓
- 可溶性人PD-L1胞外域的制备及其鉴定
- PD-L1(又称B7-H1)是近年来研究较多的B7家族的共信号分子,通过PD-1受体向T细胞传递抑制性信号,因此在调节T细胞免疫应答过程中发挥重要作用。我们已经克隆人PD-L1基因的 cDNA,构建了其胞外域的原核表达载...
- 徐丽慧何贤辉李丰耀贾仟涛查庆兵
- 文献传递
- 健康青年人HCMV特异性CD8^+T细胞频率和表型分析
- 2007年
- 目的利用负载pp65495-503抗原肽的HLA-A*0201四聚体染色结合流式细胞术,分析HLA-A2+健康青年供者外周血中HCMV pp65495-503特异性记忆CD8+T细胞的频率和表型。方法以优化的四聚体染色方法对22例中国青年供者全血进行染色,用流式细胞仪对样品进行三色荧光分析。结果健康中国青年人外周血中存在高频率的pp65495-503特异性CD8+T细胞,占CD8+T细胞的百分率为0.14~6.84%(均数2.45%);表型分析显示其CD28+细胞占四聚体阳性和四聚体阴性细胞的百分率分别为为32.5%(±21.7%)和58.58%(±10.4%)(P<0.001);CD57+细胞占四聚体阳性和四聚体阴性细胞的百分率分别为55.8%(±18.4%)和27.4%(±8.3%)(P<0.001)。同时,对三例健康青年人CD8+T细胞上多种表面分子的详细分析显示,pp65495-503特异性记忆CD8+T细胞有不同比率的细胞表达CD62L、CD45RO、CD38和CD27,而且还有一定比例的细胞表达CD45RA,但不表达活化抗原CD69分子。结论青年中国人外周血中存在高频率的HCMV特异性CD8+T细胞,这些细胞的表型存在高度异质性,可能是处于不同分化阶段的记忆和效应细胞群体组成。
- 查庆兵徐丽慧刘芳孙荭贾仟涛李丰耀何贤辉
- 关键词：人巨细胞病毒流式细胞术
- 可溶性HLA-A~*0203-BSP原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达被引量：1
- 2006年
- 目的：构建HLA—A＊0203重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽（BSP）的融合蛋白CHLA-A＊0203一BSP的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA—A28供者外周血单个核细胞（PBMC）中克隆HLA-A＊0203重链基因的cDNA，并测序鉴定，然后以PCR方法构建HLA-A＊0203一BSP的原核表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达并以免疫印迹鉴定。结果：DNA测序显示，从3名HLA-A2＊供者PBMC中克隆的cDNA中，只有从供者2获得编码HLA-A＊0203重链基因的cDNA。将编码重链胞外域1-276的序列和编码BSP的序列融合，构建HLA-A＊0203-BSP融合蛋白的原核表达载体并经测序验证。该融合蛋白在BL21（ED3）中获得高效表达，约占菌体总蛋白的30％；产物相对分子质量约为34kDa，与理论大小一致。Western印迹分析显示融合蛋白完全存在于包涵体中。结论：成功克隆HLA-A＊0203重链基因的cDNA，构建HLA-A＊0203-BSP融合蛋白的原核表达载体，并在大肠杆菌中获得高效表达，为制备HLA-A＊0203四聚体打下基础。
- 贾仟涛徐丽慧迟晓云查庆兵李丰耀何贤辉
- 关键词：人类白细胞抗原融合蛋白包涵体
- 高频等位基因HLA-A* 1101重链胞外域-BSP融合蛋白原核表达载体的构建及表达鉴定被引量：1
- 2006年
- 目的:构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶B irA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白。方法:以RT-PCR法扩增并克隆HLA-A*1101重链基因的cDNA,以PCR方法构建HLA-A11-BSP的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以免疫印迹法进行鉴定。结果:从HLA-A2阴性的供者外周血单个核细胞中克隆到HLA-A*1101重链基因的cDNA,以此cDNA为模板,将编码HLA-A*1101重链胞外域1~276序列与编码BSP的序列融合,构建HLA-A11-BSP融合蛋白表达载体,重组质粒经测序验证。融合蛋白在BL21(DE3)中诱导后获得高效表达,约占菌体总蛋白的20%;其相对分子质量约为35 000,与理论值一致。免疫印迹分析显示表达产物主要存在于包涵体中,上清液中几乎无任何产物存在。结论:成功构建表达HLA-A11-BSP融合蛋白的原核表达载体,该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式获得高水平表达。
- 李丰耀徐丽慧迟晓云查庆兵贾仟涛何贤辉
- 关键词：包涵体
- 负载HCMV pp65抗原肽的HLA-A*1101-GPI四聚体的制备和鉴定
- 2006年
- 为体外复性制备负载人巨细胞病毒(HCMV)pp65抗原肽的HLA-A*1101-GPI四聚体,研究优化HLA-A*1101重链与生物素化酶底物肽融合蛋白(HLA-A*1101-BSP)在大肠杆菌中的诱导表达的温度、时间和诱导剂IPTG浓度,并以抗HLA-A*0201抗血清进行免疫印迹鉴定HLA-A*1101-BSP的表达水平。将初步纯化的HLA-A*1101-BSP与β2-微球蛋白(β2m)和HCMV抗原肽pp6516-24(GPISGHVLK,简称GPI)一起利用稀释法进行重折叠复性,获得可溶性HLA-A*1101-GPI单体,经生物素化和纯化后,与Streptavidin-PE结合成四聚体。流式细胞仪分析显示HLA-A*1101-GPI四聚体具有与特异性细胞毒T细胞(CTL)的结合活性,表明成功获得可溶性HLA-A*1101-GPI四聚体,为研究HLA-A*1101限制性CTL的免疫应答打下基础。
- 李丰耀查庆兵徐丽慧迟晓云贾仟涛何贤辉曾耀英
- 关键词：四聚体巨细胞病毒
- 可溶性人sPD-L1及其抗体的制备和鉴定被引量：3
- 2007年
- 通过固定化金属离子亲和层析进行柱上复性与纯化,获得高纯度的可溶性PD-L1胞外域(sPD-L1),其纯度达95%,纯化的sPD-L1经免疫印迹分析得到验证,并具有与其受体PD-1的特异性结合活性;以该抗原免疫小鼠获得高滴度的抗血清,并以制备的sPD-L1-HiTrap亲和层析柱纯化获得高纯度特异性抗体;将该抗体与另一商业化抗体结合建立了一种灵敏的双夹心ELISA法,检测范围为1ng/mL^100ng/mL,可用于分析可溶性PD-L1的含量。可溶性sPD-L1及其抗体的制备不仅可用于人体内特异性抗体和可溶性PD-L1的检测,同时也为进一步研究其体内外活性及其受体的性质提供了条件。
- 徐丽慧迟晓云李丰耀贾仟涛查庆兵何贤辉
- 关键词：PD-L1原核表达重折叠抗体
- HLA-A*0203-BSP的表达和复性及其四聚体的鉴定
- 2007年
- 目的优化诱导条件大批量表达生物素化酶BirA底物肽(BSP)与HLA-A0203重链胞外域的融合蛋白(HLA-A0203-BSP),并制备负载HLA-A0203限制性EB病毒抗原肽EBNA3596-604的四聚体(HLA-A0203/SVR)。方法以HLA-A0203-BSP原核表达载体转化E.coliBL21(DE3)菌株,优化诱导条件进行大批量重组蛋白的表达。通过稀释法复性可溶性HLA-A0203/SVR单体,然后以BirA对其进行生物素化,并以阴离子交换树脂纯化。将纯化的HLA-A0203/SVR单体与荧光素标记的链亲和素按4∶1的比例混合形成四聚体,通过对特异性CTL进行染色验证其结合活性。结果当IPTG的浓度为0.4mmol/L,于37℃诱导过夜后,融合蛋白的表达最多。该重组蛋白相对分子质量(Mr)为34000,与HLA-A0203-BSP的理论Mr相一致。该重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀部分,约占菌体总蛋白的30%。负载抗原肽的可溶性HLA-A0203/SVR单体是在同时存在HLA-A0203-BSP、β2微球蛋白及HLA-A0203限制性抗原肽SVR的情况下通过稀释法复性而获得。该单体生物素化并纯化后与荧光素标记的链亲和素按4∶1的比例混合后即形成四聚体。流式细胞术(FCM)分析证实,该四聚体具有与HLA-A2+供者特异性CTL结合的活性。结论HLA-A0203-BSP融合蛋白在优化条件下获得高效表达。以此蛋白制备的HLA-A0203/SVR四聚体具有与HLA-A2+供者特异性CTL结合的活性,为研究HLA-A0203个体EB病毒特异性CTL的免疫应答打下了基础。
- 贾仟涛徐丽慧查庆兵李丰耀何贤辉曾耀英
- 关键词：EB病毒四聚体包涵体
