黄德圣
- 作品数：4 被引量：1H指数：1
- 供职机构：安徽医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市科学技术委员会基础研究重点项目安徽省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 构建SPA和SPG单结构域随机组合噬菌体展示文库
- 2010年
- 目的构建免疫球蛋白结合分子金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)和链球菌蛋白G(SPG)单结构域随机组合噬菌体展示文库,为研究其分子功能与结构的关系奠定基础。方法 PCR扩增制备SPA的A、B、C、D、E结构域和SPG的B2结构域核苷酸片段,在片段两端通过引物引入XbaⅠ酶切位点和保护碱基,3'端引入3个氨基酸大小的随机连接肽核苷酸序列,各结构域核苷酸片段经XbaⅠ酶消化,在T4连接酶作用下随机相互连接并克隆于噬菌体展示载体pCANT-AB5S,克隆产物转化E.coliDH5α,提取原代库质粒转化E.coliTG1,经M13K07辅助噬菌体拯救,构建成SPA和SPG单结构域随机组合噬菌体展示文库。结果该噬菌体展示文库库容量为1.87×107cfu,滴度为1.3×1014TU/ml,文库的片段插入率近100%,其中插入多个结构域的阳性克隆占21.7%,序列分析显示各结构域之间的连接和随机连接肽序列具有随机性。结论成功地构建了SPA和SPG单结构域随机组合噬菌体展示文库,该文库在库容量、多样性和随机性方面满足体外分子进化研究的要求。
- 黄德圣潘卫曹洁庞强唐萍廖文婷李存枚陈秋莉邓松华
- HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体的构建及在大肠杆菌中的高效表达
- 2009年
- 目的构建HIV-1HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行高效表达和纯化。方法应用PCR拼接的方法将首轮合成Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸,22～37位氨基酸)移位至缺失半胱氨酸富集区的Tat(△C)的N末端,获得其突变体序列(Tat(CN)DNA),构建其原核表达质粒pET32a-Tat(CN),并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,经SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物,纯化后的产物用间接ELISA进行鉴定。结果构建了pET32a-Tat(CN)突变体,pET32a-Tat(CN)融合蛋白在大肠杆菌中表达水平为5.17mg/ml,相对分子质量为31ku。间接的ELISA结果表明,pET32a-Tat(CN)能与Tat兔抗血清呈特异反应。结论成功构建了HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区移位至TatN端的突变体,并能在大肠杆菌中高效表达,其纯化的蛋白pET32a-Tat(CN)很好地保留了与HIV-1Tat兔抗血清的免疫反应性,为HIV-1Tat的疫苗基础研究提供了一有价值的研究结论。
- 李存枚潘卫曹洁王锦红黄德圣庞强廖文婷邓松华
- 关键词：TAT
- 用兔IgG筛选噬菌体展示免疫球蛋白结合分子组合文库被引量：1
- 2009年
- 目的应用噬菌体展示免疫球蛋白(Ig)结合分子组合文库,进化筛选获得与兔IgG结合的代表性序列,测定其与兔IgG及人IgG结合活性的差异,以判断筛选获得的代表性序列对不同种属Ig的结合是否存在倾向性的差别。方法应用包含Ig效应子结合蛋白Protein A的D结构域(PA-D)、A结构域(PA-A),Protein G的B2结构域(PG-B2)及protein L的B3结构域(PL-B3)的单结构域随机组合文库,以兔IgG对该组合文库进行进化筛选,序列比较分析筛选获得的代表性序列与人IgG进化筛选文库所得代表性序列的异同性;用ELISA和竞争抑制试验分别测定阳性噬菌体克隆与兔IgG及人IgG的结合活性。结果以兔IgG经4轮分子进化筛选,获得在天然细菌蛋白中不存在的新的结构形式PA-A—PA-A,该结果与人IgG进化筛选所得代表性序列PA-A—PG有显著差异;兔IgG筛选序列PA-A—PA-A和人IgG筛选序列PA-A—PG分别显示出与兔Ig和人Ig结合力更强的特性。结论该研究首次应用噬菌体展示技术研究不同种属抗体效应子构象的不同,证实兔IgG和人IgG两者效应子构象之间确实存在差异。这一结论有助于阐明抗体效应子构象在不同种属之间的差异性。
- 唐萍潘卫曹洁廖文婷陈秋莉黄德圣庞强王锦红邓松华
- 关键词：免疫球蛋白类免疫球蛋白G
- 人类免疫缺陷病毒1型HXB2株Tat突变体的构建、原核表达及免疫原性分析
- 2009年
- 目的构建HIV一1HXB2株Tat基因半胱氨酸富集区3’末端移位突变体，经原核表达和纯化，分析该突变体蛋白（Tat—cct）的免疫原性。方法用PCR方法将HIV一1HXB2株Tat基因的半胱氨酸富集区（64～111位核苷酸）移位至Tat基因的3’末端，获得其突变体DNA序列，并构建其原核表达质粒pET32a—Tat—oct，转人大肠埃希菌E．coliBL21（DE3）中进行诱导表达及纯化。以Tat—cct融合表达蛋白免疫BALB／c小鼠，ELISA方法对该抗血清进行免疫原性检测分析。结果pET32aTat—cct重组质粒可在E．coliBI。21（DE3）中诱导表达，纯化后其融合蛋白相对分子质量约为31000。Tat—cct重组蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体滴度为1：1600，该抗体与Tat—cot蛋白和Tat蛋白（1～101位氨基酸）均呈特异性结合反应。结论Tat突变体重组蛋白Tat—cct能在大肠埃希菌中有效表达，并较好保留其免疫原性，为HIV一1Tat疫苗的基础研究提供了有价值的实验结论。
- 李存枚邓松华曹洁王锦红陈璐黄德圣潘卫
- 关键词：HIV-1基因产物TAT重组蛋白质类免疫
