中西秀树
- 作品数：35 被引量：37H指数：3
- 供职机构：江南大学生物工程学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金教育部科学技术研究重大项目中央高校基本科研业务费专项资金更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程医药卫生化学工程更多>>
- 酿酒酵母孢子“微胶囊”表面展示乙醛脱氢酶以及检测乙醛的应用
- 2024年
- 乙醛是对人体有毒的化合物,乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)能将乙醛氧化为无毒的乙酸,同时将NAD(P)+转化为NAD(P)H。目前检测乙醛的方法繁琐且耗时费力,该研究采用酿酒酵母孢子“微胶囊”表面展示热带假丝酵母(Candida tropicalis)LBBE-W1来源的乙醛脱氢酶,建立一种新颖快速检测乙醛的方法。首先,基于蛋白质免疫印迹与荧光结果证实ALDH能够在孢子中表达且定位在孢子壁上。然后,测定了孢子表面展示ALDH与游离ALDH的酶学性质。结果显示,孢子表面展示ALDH和游离酶的最适温度与pH值分别为40℃和9.0;与游离酶相比,孢子表面展示ALDH具有更高的活性,以及更佳的温度与pH稳定性。此外,孢子表面展示ALDH对十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、蛋白酶K具有更强的耐受性;孢子表面展示ALDH与游离乙醛脱氢酶的最适底物都是乙醛,并且孢子表面展示ALDH具有良好的重复使用性能。最后,将孢子表面展示ALDH作为生物传感器检测乙醛,结果表明在0~500μmol/L的乙醛浓度范围内具有良好的线性关系,其R2值为0.9992。该研究成功构建一种新颖的生物传感器,为乙醛的检测提供一种新的方法。
- 杜祥坤费康清王亚森白佳文中西秀树李子杰
- 关键词：乙醛脱氢酶生物传感器酿酒酵母
- 酿酒酵母糖基化缺陷型菌株中ALG6基因的过量表达
- 2015年
- 利用酿酒酵母生产人源化糖蛋白,需对其糖基化途径进行基因工程改造。酿酒酵母糖基化相关基因ALG3、OCH1、MNN1的敲除导致胞内糖蛋白低的N-聚糖位点占有率和菌株缓慢的生长速度。为了提高糖基化缺陷型菌株的N-聚糖位点占有率,酿酒酵母的ALG6基因被过量表达。结果表明,ALG6的过量表达不仅能够提高菌株N-聚糖位点占有率,还能回补其生长速度,提高外源蛋白人类溶菌酶的分泌效果。
- 张阁元徐沙高晓冬中西秀树
- 关键词：酿酒酵母人源化糖蛋白
- Ogataea minuta来源的内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的异源表达和纯化
- 2018年
- 在大肠杆菌中表达有活性的Ogataea minuta来源的内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(EndoOm),利用p ET系统过量表达Endo-Om。在优化宿主菌及培养条件后,镍柱纯化目的蛋白质,并检测纯化后的Endo-Om对荧光标志的寡糖链的水解活性。经IPTG诱导后,目的蛋白质可以很好地表达,但大部分存在包涵体中。通过培养条件优化,16℃在Overnight ExpressTMInstant LB培养基(默克)中培养,实现了Endo-Om在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化,并检测到了纯酶的水解活性。在大肠杆菌中成功纯化了有活性的Endo-Om蛋白,为加速研究该酶的结构和功能奠定了基础。
- 贾元苓喜多岛敏彦李子杰高晓冬中西秀树
- 关键词：异源表达纯化
- 酿酒酵母中表达神经肉毒素A及其功能研究
- 2019年
- 肉毒神经毒素(BoNT)是肉毒梭菌产生的神经毒素,是最强大的毒素之一。为了研究肉毒神经毒素A在酵母中的活性及功能,在酿酒酵母细胞中表达BoNT/A LC,观察其对酵母生长影响以及通过蛋白免疫印迹方法研究其在酵母中蛋白表达水平。结果表明:BoNT/A抑制野生型酵母的生长;在酿酒酵母细胞中BoNT/A具有水解酶活性,当其活性位点突变后,BoNT/A突变体的表达不会抑制酿酒酵母的生长;过量表达酵母的SNAP25同源基因SEC9可以回补BoNT/A轻链过表达的酵母的生长。在BoNT/A轻链表达的酵母细胞中,其催化活性可以通过酵母的生长来检测。因此,这类特殊的酵母细胞可以用来分析BoNT/A。
- NDIKUBWIMANA Jean de Dieu邵侃凯高晓冬中西秀树
- 关键词：酿酒酵母
- 酿酒酵母孢子固定化酶技术及其应用（英文）
- Yeast spore wall has a unique multilayer structure,and the first and second outermost layers are composed of d...
- 高晓冬李子杰中西秀树
- 关键词：固定化酶酿酒酵母
- 文献传递
- 基于RhaD醛缩酶的“一锅四酶法”合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖被引量：2
- 2013年
- 利用L-1-磷酸鼠李树胶糖醛缩酶(RhaD)以较低成本同时合成稀有糖D-山梨糖和D-阿洛酮糖。为避免直接使用价格昂贵且不稳定的底物磷酸二羟基丙酮(DHAP),以便宜的底物DL-3-磷酸甘油作为前体,采用基于RhaD和磷酸酶(AP或YqaB)的"一锅四酶法"对D-山梨糖和D-阿洛酮糖的合成进行了优化。产物D-山梨糖和D-阿洛酮糖用TLC、HPLC进行检测,并分别采用硅胶、P-2凝胶、Ca2+离子交换树脂对产物进行纯化以及1H NMR对产物进行鉴定。结果表明"一锅四酶法"以及分离纯化方法可高效地应用于D-山梨糖和D-阿洛酮糖的实际生产。该方法的建立将为其他稀有糖及其衍生物的合成提供理论依据。
- 高雅慧金则成钱超李子杰中西秀树高晓冬
- 关键词：醛缩酶
- 3-磷酸甘油醛对酵母孢子萌发的抑制作用分析
- 2025年
- 在酿酒酵母孢子中,存在糖酵解产物3-磷酸甘油醛(3-glyceraldehyde phosphate,GAP)参与的抑制萌发的负调节机制,但是目前的调控途径并不完善。该研究目的是发现GAP对萌发孢子的影响,并深入了解其负调控机制。重点分析以GAP为底物的糖酵解酶——三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)在调控机制中的作用。该文采用富营养培养基和热处理等多种条件诱导酵母孢子萌发,并通过荧光增白剂染色来测定萌发率。分别在有无GAP的条件下诱导萌发,研究GAPDH的表达水平。接着利用qPCR的方法检验GAPDH mRNA的表达水平。此外,在酵母中敲除TDH1、TDH2和TDH3这3个GAPDH的结构基因,分析突变体的萌发效率。结果显示当营养物诱导或加热处理促使孢子萌发时,GAPDH的表达水平显著降低,而在孢子萌发的过程中添加GAP反而会增加GAPDH水平。qPCR结果显示孢子萌发时GAPDH的mRNA水平没有降低,故GAPDH表达水平的降低是因为在萌发过程中蛋白被降解。且GAPDH单个结构基因的缺失会增加孢子的萌发率。结果表明GAPDH参与GAP介导的负调控机制。
- 成卓刘国玉中西秀树
- 关键词：酵母孢子萌发
- 甘油激酶的表达纯化及在酮糖合成中的应用
- 2018年
- 研究了大肠杆菌MG1655来源的甘油激酶(GK)的表达及其在酮糖合成中的应用。本研究从大肠杆菌MG1655扩增了甘油激酶的基因片段glpK,连接到表达载体pET-28a上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达,利用Ni^(2+)亲和层析柱纯化目的蛋白。利用该甘油激酶可以催化成本较低的底物甘油生成L-3-磷酸甘油,再经过磷酸甘油氧化酶(GPO)的催化生成磷酸二羟基丙酮(DHAP),生成的DHAP可以在不同的DHAP依赖性醛缩酶的催化下与受体D-甘油醛合成酮糖-1-磷酸,最终用酸性磷酸酶脱掉磷酸生成一系列酮糖。结果表明,该酶成功地用于"一釜多酶法"合成体系中,以便宜的底物甘油为前体,合成出包括稀有糖在内的一系列酮糖,生成的产物、产率及比例用TLC、HPLC进行检测。该方法的建立将为其他稀有糖及其衍生物的合成提供理论依据。
- 吴晓茹李子杰中西秀树高晓冬
- 关键词：醛缩酶酮糖
- osw2对酿酒酵母孢子固定化酶影响的分析
- 2018年
- 构建了α-半乳糖苷酶(Mel1p)的多拷贝质粒pRS426-TEFpr-MEL1,转入酿酒酵母野生型AN120及osw2△突变株并进行固定化酶活性测定。实验分别选取蜜二糖、棉子糖(三糖)与水苏糖(四糖)3种低聚寡糖作为Mel1p的底物,检测两种菌株孢子固定化酶对这3种底物的催化活性,结果表明野生型AN120酵母孢子壁的孔径最大只允许介于三糖和四糖之间的底物通过,四糖不能通过;而osw2△突变株酵母孢子壁的孔径可以允许四糖通过。通过孢子固定化酶保护性实验,发现孢子固定化酶可以完全抵抗2%SDS的处理,也可部分抵抗10%SDS的处理。通过8 mol/L尿素处理后,酶活检测发现野生型AN120酵母孢子可阻挡尿素对孢子固定化酶的影响,而osw2△孢子不能;蛋白免疫印迹分析进一步表明,尿素处理后野生型AN120酵母孢子固定化酶的含量几乎不变,而osw2△突变株孢子固定化酶的含量明显降低,说明尿素可进入osw2△突变株孢子内部溶解并降低固定化酶的含量,但对AN120酵母孢子无影响。本研究也在多种突变株孢子中表达Mel1p,并进行活性比较,发现osw2△,osw2△ydl186w△及osw2△ydr326c△突变株固定化酶均有很高的催化活性。
- 赵强李子杰中西秀树高晓冬
- 关键词：Α-半乳糖苷酶固定化酶
- 博来霉素二糖片段合成研究
- 2016年
- 目的设计合成博来霉素二糖新型前体化合物。方法以廉价易得的D-甘露糖为原料,以最短直线步骤6步实现了新型甘露糖砌块乙硫基-2-O-乙酰基-3-O-氨基甲酰基-4,6-O-苄叉基-α-D-吡喃甘露糖苷(3)的合成;以廉价易得的甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷为原料,经13步反应得到了新型古洛糖砌块对甲苯硫基-2-O-羟基-3,4,6-三-O-苄基-α,β-L-吡喃古洛糖苷(4),两个单糖砌块经糖苷化反应得到了博来霉素二糖的前体化合物对甲苯硫基-3,4,6-三-O-苄基-2-O-(2-乙酰基-3-氨基甲酰基-4,6-苄叉基-α-D-吡喃甘露糖基))-α,β-L-吡喃古洛糖(2)。结果与结论实现了新型甘露糖砌块3和新型古洛糖砌块4的合成,反应总收率分别为28%和8%;经糖苷化反应得到了博来霉素二糖前体化合物2,反应收率达83%。所有合成的新化合物均经过IR,1H-NM R,13C-NM R和HRM S进行表征。
- 蔡军涛刘中华邹小鹏郭晓强陈越磊熊兵沈竞康中西秀树尹健
- 关键词：糖苷化靶向性保护基
