郝婷婷
- 作品数：4 被引量：4H指数：2
- 供职机构：南京医科大学基础医学院微生物学系与免疫学系更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金江苏省高校自然科学研究项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- KSHV抗凋亡蛋白vFLIP编码基因的克隆表达及抗vFLIP多克隆抗体的制备与鉴定被引量：2
- 2012年
- 目的:制备由卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)编码的病毒FLICE抑制蛋白(viral FLICE inhibitory protein,vFLIP)的多克隆抗体,通过vFLIP重组蛋白对该抗体特异性进行鉴定,并将此抗体初步应用于天然病毒vFLIP蛋白表达的检测。方法:对vFLIP蛋白抗原表位进行预测分析,设计并合成3条多肽,将合成肽与载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)偶联作为抗原,免疫新西兰白兔,制备抗vFLIP的多抗;以pCDH-vFLIP质粒为模板扩增vFLIP片段,插入到真核表达载体pEF-MCS-Flag-IRES/Puro中,构建pEF-vFLIP表达载体,利用脂质体将其转染HEK293T细胞,并在其中表达vFLIP。采用ELISA、蛋白质印迹法鉴定vFLIP多克隆抗体的效价及特异性,将该抗体用于天然病毒vFLIP的检测。结果:经限制性内切酶鉴定和核酸序列测定证实成功构建了重组质粒pEF-vFLIP,Flag抗体可以特异性识别该质粒在HEK293T和EA.hy926细胞内表达的vFLIP-flag融合蛋白。进一步的ELISA结果显示,制备的兔抗vFLIP多克隆抗体效价为1∶11 000以上。该抗体不但与HEK293T和EA.hy926细胞内表达的重组vFLIP-flag融合蛋白反应,而且能够特异性识别PEL细胞中天然的病毒vFLIP蛋白。结论:构建了含vFLIP基因的重组真核表达载体;采用人工合成肽作为半抗原制备的抗KSHV vFLIP多抗,可以成功地检测重组vFLIP蛋白和天然病毒蛋白。
- 马新廷郝婷婷朱小飞卢春
- 关键词：合成肽多克隆抗体卡波济肉瘤相关疱疹病毒
- 分泌性HIV-1 Nef-EGFP融合蛋白表达载体的构建与鉴定
- 2012年
- 目的:构建含有人类免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virus type Ⅰ,HIV-1)负性调节因子(nega-tive regulation factor,Nef)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的重组融合蛋白分泌性表达载体,并检测该融合蛋白在真核细胞中的表达及其在培养上清中分泌情况,为进一步研究Nef功能奠定基础。方法:利用PCR扩增出HIV-1 Nef和EGFP基因,插入到分泌性表达载体pSecTag2B中。构建的pSecTag2B-Nef-EGFP融合蛋白表达质粒,转染293T细胞,荧光显微镜下观测细胞中Nef-EGFP融合蛋白的表达。收集细胞及上清液,蛋白质印迹和ELISA法分别检测Nef-EGFP融合蛋白的表达及其分泌。结果:限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列测定证实,成功构建了含有Nef-EGFP基因的分泌性表达载体,该质粒转染293T细胞后,蛋白质印迹法能够检测到Nef-EGFP融合蛋白的表达条带,ELISA法检测上清液中目的蛋白分泌量为1.7 ng/ml。结论:成功构建含有Nef-EGFP的融合蛋白表达质粒,融合蛋白Nef-EGFP在293T细胞中获得表达,并能分泌到胞外。
- 郝婷婷马新廷朱小飞卢春
- 关键词：增强型绿色荧光蛋白融合蛋白
- 卡波氏肉瘤病毒K1蛋白在血管内皮细胞中的表达及其功能初探
- 2013年
- 目的:获得稳定表达卡波氏肉瘤病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)K1蛋白的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),探究K1蛋白对HUVECs增殖和迁移能力的影响。方法:从本实验室已构建好的含KSHV K1基因的重组真核表达质粒pCI-neo-K1中扩增出K1基因,克隆入慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green中构建重组质粒pHAGE-K1。利用脂质体将pHAGE-K1与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,收集培养上清经0.45μm滤膜过滤即获得慢病毒悬液。病毒感染HUVECs,Western blot检测K1蛋白的表达。通过绿色荧光蛋白进行流式分选、Western blot验证获得稳定表达K1蛋白的HUVECs。通过细胞增殖实验和细胞划痕实验检测K1蛋白对HUVECs增殖和迁移能力的影响。结果:核酸序列测定证实,克隆的K1基因全长906 bp,与GenBank中登记的K1基因100%同源。Western blot结果显示,含K1基因的重组慢病毒感染的HUVECs在约46 000处可观察到一特异性条带,与预期的K1蛋白大小一致。流式分选获得稳定表达K1蛋白的HUVECs,其增殖能力与对照组相比显著增强(P<0.01),细胞迁移能力亦明显增加(P<0.05)。结论:成功包装了含KSHV K1基因的重组慢病毒。KSHV K1蛋白能够促进HUVECs增殖和迁移。
- 程晓东薛敏郝婷婷秦娣卢春
- 关键词：增殖
- HSV-1作用于KSHV ORF50启动子区中特异性应答位点序列的初寻被引量：2
- 2011年
- 目的:构建卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)ORF50启动子系列截短序列克隆,初步寻找HSV-1作用于KSHV ORF50启动子区中特异性应答位点序列。方法:以KSHV基因组为模板,PCR扩增KSHVORF50启动子系列截短序列,克隆至含有虫荧光素酶(Luciferase)报告基因的基本载体pGL-3中,构建含ORF50启动子系列截短序列的重组Luciferase报告质粒。系列重组报告质粒经酶切鉴定和序列测定分析后,分别转染单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染后的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),进行Luciferase活性检测,计算并比较相对Luciferase活性单位(Relative luciferase activity unit,RLU)。结果:成功分离、克隆KSHV ORF50启动子系列截短序列;HSV-1感染随后转染重组质粒p50-95、p50-46和p50-17与转染p50-1500、p50-750、p50-375及p50-185相比,Vero细胞中Luciferase活性显著下降。结论:成功构建了含KSHV ORF50启动子系列截短序列的重组Luciferase报告质粒;HSV-1所对应的、能够主导ORF50启动子活性的最小顺式调控区位于-185 bp和-95 bp之间。
- 程伟郝婷婷王子盾朱小飞冯宁翰华立新秦娣卢春
- 关键词：KSHVHSV-1虫荧光素酶
