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转录因子XBP1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备被引量：8: 2004年; 人X盒结合蛋白 1(XBP 1)为一种转录因子 ,与多种肿瘤的发生、发展有密切关系 .XBP 1有2种剪切形式 ,即XBP 1S和XBP 1U .将这 2种剪切形式中的一段相同编码序列 (编码 82～ 14 7位氨基酸 )重组于谷胱甘肽S转移酶 (GST)融合蛋白表达载体pGEX KG中 ,构建成重组质粒pGST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 ) .将该重组质粒转化E .coliDH5α后 ,表达GST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 )融合蛋白 ,经谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析获得纯化的融合蛋白 .用此融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体 .利用制备的抗体分别用Western印迹和免疫细胞化学检测XBP 1的 2种剪切形式在哺乳动物细胞中的表达 .结果表明 ,该抗体对XBP 1的 2种剪切形式均具有反应原性 ,效价高 ,特异性好 ,可以用于进一步研究XBP; 刘雨飞丁丽华郝春芳方言赵福弟黄翠芬杨晓叶棋浓; 关键词：多克隆抗体

人Pescadillo能够诱导大规模染色质伸展被引量：6: 2005年; 人Pescadillo基因编码的蛋白分子中含有一个BRCT结构域,Pescadillo在DNA合成、细胞增殖和转化中发挥重要作用.考虑到BRCT结构域能够诱导大规模染色质伸展,对Pescadillo 在大规模染色质伸展中的作用进行了研究.首先从人乳腺MCF10A细胞中得到了Pescadillo编码区的cDNA,其序列在第580-582位氨基酸发生缺失,将该cDNA片段与lac阻遏物在AO3-1细胞中融合表达,通过lac阻遏物结合细胞基因组中含有lac操纵基因的区域将Pescadillo靶向至染色质周围,发现Pescadillo能够诱导大规模染色质伸展,并将诱导大规模染色质伸展活性的结构域定位至其BRCT结构域,这为深入理解Pescadillo的重要作用提供了新的线索.; 张浩方言黄翠芬杨晓叶棋浓; 关键词：蛋白质分子染色质氨基酸基因 DNA

Smad4诱导大规模染色质伸展结构域定位: 2004年; 目的 :了解Smad4能否调节大规模染色质结构改变并对其功能区域进行定位。方法 :将Smad4及其缺失突变体与 pRC lac载体上lac的阻遏物融合并在AO3 1细胞中表达。该细胞株由CHO细胞衍变而来 ,整合有 2 5 6个拷贝串联排列的lac操纵基因。在lac操纵子基因上游含有DHFR基因 ,可用甲氨蝶呤 (MTX)进行基因共扩增。在细胞中lac阻遏物识别和结合lac操纵子基因。用抗lac阻遏物抗体进行免疫组化试验 ,荧光显微镜下观察染色质结构的改变。结果 :野生型Smad4 (1～ 5 5 2aa)有一定的诱导染色质伸展能力 ,且不依赖于TGF β。N端区域 (1～ 15 0aa)、中间连接区域 (130～ 32 5aa)没有诱导大规模染色质伸展活性。C端区域 (2 6 0～ 5 5 2aa)有一定的诱导染色质伸展能力 ,而C端缺失 38个氨基酸残基的区域 (2 6 0～ 5 14aa)能强烈地诱导大规模染色质伸展。结论 :Smad4诱导大规模染色质伸展结构域位于 2 6 0～ 5 14位氨基酸之间 ,C端 38个氨基酸对Smad4诱导大规模染色质伸展有抑制作用。对Smad4诱导大规模染色质伸展活性特性的研究为揭示Smad4在肿瘤发生发展中的作用机制提供了新的途径。; 严景华方言吕秋军黄翠芬杨晓叶棋浓; 关键词：SMAD4 结构域

XBP-1转录激活系统的构建: 2004年; 人X盒结合蛋白1(XBP-1)是CREB/ATF(cAMP应答元件结合蛋白/激活转录因子)转录因子家族中的一员,在很多癌细胞中高水平表达。将XBP-1两种剪切形式的编码序列分别克隆在pRC-lac真核载体上,构建成pRC-lac-XBP-1S和pRC-lac-XBP-1U重组质粒。Western印迹分析表明,这两种XBP-1形式在哺乳动物细胞中都得到了表达。瞬时转染人胚胎肾细胞293T,用荧光素酶报告基因检测这两种剪切形式的转录活性。结果显示,pRC-lac-XBP-1S和pRC-lac-XBP-1U在293T细胞中均有活性,pRC-lac-XBP-1U的活性约是空载体的65倍,pRC-lac-XBP-1S的活性约是空载体的3倍。成功构建了XBP-1的转录激活系统,为进一步了解XBP-1在各种疾病中的作用奠定了基础。; 方言严景华丁丽华赵海泉黄翠芬杨晓叶棋浓; 关键词：XBP-1 转录活性克隆

乳腺癌转移、侵袭相关基因研究: 2004年; 乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤。每年约有30 %的乳腺癌患者发生癌细胞转移现象,导致发病率及死亡率上升,成为影响其疗效的主要原因。了解乳腺癌转移、侵袭相关基因对于预防和治疗乳腺癌转移具有重要作用。对近年来发现的乳腺癌转移、侵袭相关基因作一综述。; 方言叶棋浓黄翠芬; 关键词：乳腺癌相关基因

FHL2与IGFBP-7存在直接相互作用: 2005年; 目的:利用酵母双杂交技术筛选FHL2的相互作用蛋白,为进一步研究FHL2的功能奠定基础。方法:从卵巢文库中钓取FHL2cDNA,构建诱饵蛋白载体pAS2-1-FHL2,利用酵母双杂交筛选技术,在卵巢文库中筛选与FHL2相互作用的蛋白。将含有pACT2-候选基因的酵母菌与含有pAS2-1-FHL2的酵母菌进行交配实验,利用LacZ报告基因检测FHL2与候选蛋白之间是否存在相互作用。将FHL2和候选蛋白分别构建到pGEX-KG和pET-28a上,并纯化GST-FHL2和His-候选蛋白融合蛋白,利用GST沉淀实验进一步验证FHL2和候选蛋白的体外相互作用。结果:所获取的候选蛋白为IGFBP-7,是胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)家族中的一员。交配实验表明,IGFBP-7与FHL2能特异性地相互作用,而不与空载体或BRCT1对照相互作用。GST沉淀实验进一步验证,IGFBP-7能与FHL2结合,而不与GST结合。结论:FHL2和IGFBP-7在体内及体外均可发生特异性的相互作用。; 丁丽华焦园园刘雨飞方言周蕾王晓辉黄翠芬叶棋浓; 关键词：FHL2 相互作用酵母双杂交

一种含多个CCP结构域的新型基因的克隆及生物学特性初探被引量：3: 2005年; 目的克隆并分析新型基因CCP22,研究其结构及初探生物学特性。方法常规分子克隆、生物信息学分析、Westernblot、RT-PCR。结果利用酵母双杂交技术从人乳腺文库中分离到一种含有22个补体调控蛋白(complement control protein,CCP)序列元件的新基因,命名为CCP22。生物信息学分析发现,该基因定位于人染色体9q31.2-32,共15个外显子,基因编码序列全长4494bp,编码1497个氨基酸。将CCP22基因全长编码序列克隆于真核载体中,该表达载体转染人胚肾细胞293T后获得的表达产物经Westernblot证实CCP22属于分泌蛋白。将CCP22与绿色荧光蛋白(EGFP)标签融合后证实CCP22主要分布在细胞核外。Northernblot证实,内源性CCP22mRNA转录本全长约6kb。RT-PCR检测表明,CCP22在正常乳腺细胞株中高表达,而在多种乳腺肿瘤细胞株中不表达或低表达。结论CCP22在乳腺肿瘤发生发展中可能发挥重要作用。; 韩聚强方言严景华焦园园吕秋军黄翠芬杨晓叶棋浓; 关键词：克隆乳腺癌

与雌激素受体β相互作用的蛋白的分离及鉴定: 2006年; 目的:从乳腺文库中分离与雌激素受体β(ERβ)相互作用的蛋白质。方法:将ERβ基因克隆入酵母表达载体pGBKT7中,利用酵母双杂交筛选技术,从乳腺文库中分离与ERβ相互作用的蛋白质。结果:分离到与ERβ相互作用的蛋白质FBLN1,并进一步确定了ERβ与FBLN1作用的结构域为AF1及DBD结构域。结论:FBLN1可能参与ERβ信号途径并共同调节细胞的增殖。ERβ与FBLN1相互作用的发现为进一步研究ERβ与FBLN1在生理及病理中的作用奠定了基础。; 刘雨飞周蕾丁丽华方言张浩黄翠芬叶棋浓; 关键词：雌激素受体Β 酵母双杂交相互作用

雌激素受体与Ⅰ型胶原蛋白存在相互作用被引量：1: 2006年; 目的:利用酵母双杂交技术筛选与雌激素受体(ER)αAF1转录激活结构域相互作用的蛋白,为乳腺癌发生、发展机制的研究奠定基础。方法:将编码ERαAF1的cDNA片段克隆到诱饵蛋白载体pGBKT7中,以构建的pGBKT7-ERα-AF1为表达靶蛋白的质粒,筛选人乳腺文库。将筛选到的含Ⅰ型胶原基因的质粒与表达ERα和ERβ不同结构域的质粒共转化酵母细胞,验证Ⅰ型胶原与ERαAF1作用的特异性。结果:经酶切鉴定,证实重组质粒pGBKT7-ERα-AF1含有目的基因片段;Western印迹证实ERαAF1在酵母中获得表达;酵母双杂交筛选得到与ERαAF1相互作用的Ⅰ型胶原蛋白。酵母细胞共转化实验证实,Ⅰ型胶原蛋白与ERα和ERβ的AF1结合,但与ERβ的DBD、AF2不结合。结论:Ⅰ型胶原与ERα和ERβ的AF1及ERβ的DBD存在相互作用。; 周蕾刘雨飞丁丽华方言李杰之冯威健叶棋浓; 关键词：雌激素受体酵母双杂交相互作用

FHL家族的克隆及其融合蛋白的纯化被引量：4: 2006年; 目的:纯化FHL家族(FHL1～FHL5)融合表达蛋白。方法:用PCR方法从乳腺文库和卵巢文库中扩增FHL1～FHL5编码序列,将其以正确相位与pGEX-KG载体中的GST编码序列融合,将重组质粒分别转化E.coliDH5α后,用谷胱甘肽-Sepharose4B纯化融合蛋白,并用Westernblot检测融合蛋白的表达。结果:构建得到FHL1～FHL5的融合表达载体,West-ernblot检测表明GST-FHL1～GST-FHL5共5种融合蛋白均成功表达,并纯化得到融合蛋白。结论:成功克隆FHL1～FHL5基因,并得到纯化的融合蛋白。; 丁丽华方言严景华袁斌韩聚强吕秋军叶棋浓; 关键词：FHL 克隆融合蛋白

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