冯连荣
- 作品数：18 被引量：16H指数：3
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- 偏肿革裥菌锰过氧化物酶的分级纯化被引量：1
- 2017年
- 【目的】研究白腐菌偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)锰过氧化物酶(MnP)的分级纯化,以期得到L.gibbosa MnP的纯品和进行后续酶学性质研究。【方法】在对L.gibbosa所产MnPs进行优化培养、获得大量MnPs粗酶液的基础上,通过硫酸铵(NH4)2SO4分级盐析、聚乙二醇(PEG)沉淀进行粗酶液浓缩、在起始缓冲液中进行透析、经DEAE-琼脂糖CL-6B离子交换柱层析进行梯度洗脱和葡聚糖G-75凝胶过滤柱层析等方法对MnPs粗酶液进行纯化,并对分级纯化方法进行优化,对纯化浓缩后的纯酶样品采用SDS-PAGE方法进行酶纯度检验。【结果】在75%、80%和85%这3种(NH_4)_2SO_4饱和度中,85%的(NH_4)_2SO_4是沉淀MnPs的适宜饱和度,在该饱和度下测得上清液中酶活为3.63 U·L^(-1),蛋白浓度为0.132 mg·mL^(-1),表明MnPs已基本沉淀完全;试管小试法确定离子交换柱层析中上样的最适缓冲体系为pH7的Na_2HPO_4-NaH_2PO_4起始缓冲液;离子交换柱层析后收集的洗脱液检测到3个蛋白吸收峰,其中只在第2个蛋白吸收峰中检测出MnP活性,该MnP活性值变化曲线与蛋白吸光值一致。这个活性峰经凝胶过滤柱层析后,洗脱结果只出现1个明显的蛋白吸收峰,在其中检测出较高的MnP活性;浓缩后的冻干样品经SDS-PAGE电泳检测只在约40 k Da处有1条清晰的蛋白谱带,表明对MnP的纯化已达到电泳纯。【结论】筛选出85%饱和度的(NH_4)2_SO_4盐析法是初期沉淀与纯化L.gibbosa所产MnPs的最适方法;PEG浓缩法简便、易行、有效;初期浓缩后再经过离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析可以得到电泳纯的MnP纯化样品。
- 张玉龙池玉杰冯连荣
- 关键词：锰过氧化物酶纯化
- 偏肿革裥菌锰过氧化物酶酶学性质和染料脱色被引量：3
- 2017年
- 【目的】研究白腐菌偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)所产锰过氧化物酶(MnP)纯酶的序列特征、酶学性质及其对染料的脱色能力,为其应用于木质素降解、染料脱色奠定基础。【方法】将纯化后的样品经SDS-PAGE检测后获得的唯一L.gibbosa MnP条带切割,采用Nano液相色谱-电喷雾串联质谱法联用(Nano LC-ESI-MS/MS)多肽测序技术对蛋白氨基酸序列进行测定。利用该SDS-PAGE图谱,建立蛋白分子量与迁移率的标准直线,从标准直线上求出MnP纯酶样品的表观分子量;参照酶活测定方法检测最适反应温度及温度稳定性、最适反应p H值及p H稳定性;采用lineweaver-Burk双倒数作图法求解米氏动力学常数Km值。研究L.gibbosa菌种培养液和MnP纯酶液对蒽醌类的茜素红、偶氮类的刚果红、杂环类的中性红和三苯基甲烷类的结晶紫等4种不同类型染料的脱色能力。【结果】串联质谱扫描出2条MnP的保守序列肽段,与克隆到的基因Lg-mnp1编码的Lg-MnP1(Gen Bank登录号:ACO92620)序列完全吻合,表明其所代表的酶蛋白Lg-MnP1就是唯一电泳带中主要的蛋白。Lg-MnP1的表观分子量为45.39 k Da,最适反应温度为35℃,在低于40℃的条件下都具有一定的催化能力,但温度超过50℃后迅速失活;其最适反应pH值为3.5,p H超过4.5反应程度就迅速下降,在p H为2~3时最稳定;在以2,6-DMP为底物时,在21℃条件下其米氏常数Km为6.124 mmol·L^(-1)。L.gibbosa培养液对染料在1 h的脱色率分别为茜素红100%、中性红22.17%、刚果红19.09%,对结晶紫的脱色率很低,在36 h脱色率仅为0.018%。纯化后的Lg-MnP1溶液对染料的最大脱色率在2 h分别为中性红100%、刚果红95.55%、茜素红75.85%和结晶紫36.57%。【结论】SDS-PAGE得到的唯一一条电泳带中的MnP是Lg-MnP1。Lg-MnP1是一种中温性、偏酸性的酶,与2,6-DMP的亲和力较大。L.gibbosa含有菌丝的培养液对茜素红具有彻底的降解效果,但Lg-MnP1纯酶�
- 张玉龙池玉杰冯连荣
- 关键词：锰过氧化物酶纯化酶学性质染料脱色
- 一种液体菌丝收集装置
- 本实用新型目的是提供一种液体菌丝收集装置，其组成包括上下两部分装置，上部分为菌丝挤压装置，所述的菌丝挤压装置组成包括圆柱形手柄、实心圆柱饼，所述的圆柱形手柄连接在实心圆柱饼中心构成菌丝挤压装置，下部分为菌丝液体培养基过滤...
- 张健池玉杰赵清泉冯连荣
- 文献传递
- 迷宫栓孔菌热激蛋白基因的生物信息学与表达分析
- 2023年
- 为了探究迷宫栓孔菌(Trametes gibbosa)热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)家族的功能及结构,对经木屑处理不同时间点的菌丝样品进行cDNA建库,然后根据转录组数据筛选该菌株的所有HSPs基因并进行生物信息学分析;针对HSP100家族进行基因克隆和序列结构分析,并利用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)对其在木屑处理下的表达量进行验证。结果如下:在迷宫栓孔菌中共筛选出32个HSPs基因,其编码的蛋白分为5个亚类,分别为HSP100(2个)、HSP90(2个)、HSP70(7个)、HSP60(1个)和小分子热激蛋白[small HSPs(sHSPs),20个],它们在菌体生长调控中具有蛋白翻译后修饰、蛋白质折叠、伴侣蛋白等重要功能。这些HSPs都为疏水蛋白,不同亚类的HSPs理化性质有所差异。HSP100由N-端、核苷酸结合域1(nucleotide-binding domain 1,NBD1)、NBD2、2个NBDs间的接头构成,其中,NBDs具有十分保守的Walker A、Walker B基序及精氨酸指残基。qRT-PCR扩增结果表明,在木屑处理下迷宫栓孔菌HSP100基因表达量有明显上调趋势。综上所述,迷宫栓孔菌中HSPs家族种类多且复杂,在应激情况下HSP100家族承担了重要的蛋白质解聚功能,其序列及结构相对保守。本研究结果为迷宫栓孔菌在胁迫应激方面的研究提供了理论依据。
- 杨旭欣冯连荣池玉杰池玉杰
- 关键词：白腐菌热激蛋白基因克隆生物信息学
- 杨叶枯病病原菌生物学特性、防治药剂筛选及杨树抗病性评价
- 2024年
- 为防治杨树叶枯病,利用单因素试验,对中荷64杨(P.×euramericana cv.‘N3016’)上分离获得的链格孢菌(Alternaria alternata)进行了生物学特性及室内防治药剂筛选研究,并开展了不同品种杨树抗叶枯病综合评价。结果表明:链格孢菌菌丝生长的适宜培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基,适宜碳源为玉米粉,适宜氮源为酵母提取物,适宜培养温度范围为25~30℃,适宜pH为8,光照条件对菌丝生长影响不大,致死温度为52℃。采用生长速率法进行室内防治药剂筛选,结果显示,选用的5种生物制剂防治效果优于2种化学药剂,各药剂抑制作用排序从大到小依次为哈茨木霉(3亿菌落/g)、枯草芽孢杆菌(100亿芽孢/g)、质量分数为10%的多抗霉素、质量分数为3%的中生菌素、质量分数为2%的宁南霉素、质量分数为50%的多菌灵、质量分数为75%的百菌清,将哈茨木霉(3亿菌落/g)和枯草芽孢杆菌(100亿芽孢/g)作为防治链格孢菌的适宜药剂。选用7个黑杨派品种杨树,利用模糊数学隶属度函数法,开展了杨树抗叶枯病综合评价,确定中荷64杨为高感品种,中辽1号杨和欧美杨177为中感品种,渤丰1号杨、渤丰3号杨、辽育3号杨和欧美杨111为高抗品种。
- 冯连荣矫丽曼张妍王乃锐王诗琦彭儒胜宋立志池玉杰
- 关键词：杨树叶枯病生物学特性药剂筛选抗病性评价
- 白桦漆酶BpLAC1基因生物信息学分析被引量：2
- 2017年
- 为了深入了解白桦漆酶BpLAC1基因的功能,利用生物信息学方法对其结构域及功能进行预测,包括开放阅读框分析、信号肽预测、基本理化性质分析、糖基化位点预测、保守结构域分析、系统进化分析、蛋白质二级及三级结构预测。结果如下:BpLAC1基因序列全长为1 677 bp,开放阅读框ORF长为1 677 bp,编码558个氨基酸,蛋白相对分子量为58.6 k Da,理论等电点为9.53,是稳定的亲水蛋白;具有2个糖基化位点和13个磷酸化位点;该蛋白含有一个信号肽,属于分泌型蛋白;含有3个Cu-oxidase保守区,属于Cupredoxin superfamily家族;系统发育树分析表明,BpLAC1蛋白与川桑亲缘关系较近,与柑橘属Citrus、鹰嘴豆属Cicer等亲缘关系相差较远。二级结构中α-螺旋占14.04%,β-转角占11.99%,不规则卷曲链39.51%,延伸链占据34.46%。
- 冯连荣宋立志赵大根王玉成池玉杰
- 关键词：白桦漆酶生物信息学分析
- 花粉管通道法介导山葡萄VaCBF3基因转化杨树的初步研究被引量：2
- 2016年
- 以美洲黑杨‘D189’和辽宁杨为杂交亲本,利用花粉管通道法,经柱头滴注,将携带山葡萄CBF3(VaCBF3)基因的质粒导入杨树中。结果显示:在杂交授粉后,经过目的基因导入,共获得了52株转化后代,经PCR检测,有5株扩增出目的条带,初步推断目的基因已导入到杨树中。本研究结果可为进一步利用花粉管通道培育抗寒杨树新品系提供参考。
- 冯连荣王占斌尹杰宋立志彭儒胜赵鑫闻
- 关键词：辽宁杨花粉管通道法
- 一种用于试管培养基灭菌试管架
- 本实用新型目的是提供一种用于试管培养基灭菌的试管架，一种用于试管培养基灭菌试管架，其组成包括试管上部环形支架，连接杆和试管底部环形托盘，所述的试管上部环形支架组成包括7个圆环互相连接，所述的连接杆组成包括7根钢条，7根钢...
- 张健池玉杰冯连荣张俊李姝璇
- 文献传递
- 茜素红处理下偏肿革裥菌细胞色素P450基因表达分析被引量：2
- 2020年
- 用蒽醌类染料茜素红在0(ck),3(QSH1),7(QSH2),10 h(QSH3)分别处理白腐菌偏肿革裥菌,构建转录组,为研究白腐菌的细胞色素P450(CYP450)基因在脱色降解茜素红机制中的作用提供理论支持。采用高通量测序技术对茜素红处理下的菌丝样本进行转录组测序,利用功能注释筛选出CYP450基因。结果表明:4个转录组共得到26.17 Gb的有效数据,与参考基因组的比对效率为71.23%~73.66%,通过功能注释搜索所有基因,共得到96个CYP450基因。通过ck与QSH1、ck与QSH2、ck与QSH3的分组比较,对所有的CYP450基因进行差异表达筛选。其中,有3个基因(gene24255、gene18992、gene7490)在3组对比中都出现。将这3个基因的0~10 h的表达量与茜素红脱色率进行比较,得出这3个基因的表达量与脱色率呈正相关。通过对KEGG通路进行分析,发现gene25488被注释到芳香化合物降解通路,初步印证了CYP450基因可能参与了偏肿革裥菌对茜素红染料的脱色。该研究从转录水平初步分析了偏肿革裥菌的CYP450基因及其产物可能参加了对茜素红降解脱色的相关代谢途径和生物学过程,获得的结果可为后续研究茜素红的降解机制提供参考。
- 张健池玉杰赵清泉冯连荣
- 关键词：细胞色素P450茜素红脱色率
- 茜素红诱导下偏肿革裥菌SSH-cDNA文库构建与差异表达基因筛选被引量：3
- 2020年
- 为了探索白腐菌偏肿革裥菌降解染料茜素红过程中的生理机制和差异表达基因,在LNAS培养基上培养菌株,以添加茜素红为处理组,加入无菌水为对照组,采用抑制性消减杂交方法构建了在染料降解过程中的差异基因cDNA文库。经过2次差减杂交后所得的阳性克隆,除去重复序列后得到75个独立基因的ESTs序列,即为差异基因的SSH-cDNA文库。文库中显著表达的差异基因主要有编码谷氨酰胺合成酶、热激蛋白70、ɑ,β水解酶、脯氨酰氨肽酶2、MFS普通基质转运蛋白、钙网结构域蛋白、20S蛋白酶体亚基α型3、3脱氧7磷酸庚酮糖合酶、醛酮还原酶、脂肪酸2羟化酶、辅酶Ⅰ黄素氧化还原酶、细胞色素P450等基因,这些差异基因及其产物参加了茜素红的氧化降解反应、糖类和蛋白质的降解作用、应激反应和信号转导途径。此研究结果可为进一步筛选偏肿革裥菌中与染料降解性状相关的基因奠定基础。
- 韩树英池玉杰张健冯连荣
- 关键词：抑制性差减杂交差异表达基因氧化还原酶热激蛋白
